鄧俊豪，李 苗，張里程，唐佩福

1解放軍總醫(yī)院 骨科，北京 100853；2北京大學深圳研究生院，廣東深圳 518055

間充質(zhì)干細胞是一類形態(tài)呈梭形、具有高度可塑性、來源廣泛的多能干細胞[1-2]。因其具有多向分化潛能、強大的旁分泌及免疫調(diào)控作用[3-4]，自Friedenstein首次報道間充質(zhì)干細胞以來[5]，已有多個動物實驗將其應用于細胞移植治療[6]，如心肌梗死[7-8]、皮膚壞死[9-10]、神經(jīng)創(chuàng)傷[11-12]等損傷修復，部分已經(jīng)開始Ⅰ期、Ⅱ期甚至Ⅲ期臨床試驗[13-16]。然而，盡管間充質(zhì)干細胞來源廣泛、易于獲取，但人們從組織中進行原代細胞分離后，僅能獲取極少數(shù)量的間充質(zhì)干細胞[17]。因此，在間充質(zhì)干細胞應用于移植治療之前，需要在體外進行細胞擴增以得到足夠數(shù)量的細胞。目前體外細胞擴增的“金標準”仍然是依賴傳統(tǒng)的培養(yǎng)皿進行二維貼壁培養(yǎng)。人體絕大多數(shù)的正常生理細胞，均以三維立體形式存在以發(fā)揮其正常功能[18-19]。因此，傳統(tǒng)二維的體外培養(yǎng)環(huán)境可能會使間充質(zhì)干細胞的許多生物學性狀難以維持，導致細胞老化、分化潛能下降及旁分泌功能受損等[20-21]。為維持細胞原有的生物學特性，我們應用并改良三維懸滴(Hanging-drop)法培養(yǎng)三維細胞[22]。之前已有相關(guān)研究報道了Hanging-drop培養(yǎng)方式在某些模型上的優(yōu)勢[23-24]，但缺乏該方法培養(yǎng)的3D細胞與傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)的2D細胞的直接對比研究，缺少直觀的證據(jù)表明此類細胞的優(yōu)勢。因此，本次研究選擇了人胎盤來源的間充質(zhì)干細胞進行實驗，從不同方面對比了2D和3D間充質(zhì)干細胞的生物學特性，為未來3D間充質(zhì)干細胞應用于移植治療提供依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑和藥品 DMEM培養(yǎng)液、青霉素/鏈霉素雙抗溶液、10%胎牛血清(Gibco公司)、0.25%Trypsin-EDTA酶(Sigma公司)、人胎盤來源的間充質(zhì)干細胞株(清華大學深圳研究生院饋贈)、Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒(Invitrogen公司)、TRIzol抽提試劑盒(Invitrogen公司)、SuperscriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司)、ELISA試劑盒(四正柏生物科技有限公司)。

2 2D間充質(zhì)干細胞培養(yǎng) 將所得人胎盤來源的間充質(zhì)干細胞株復蘇后，用富含DMEM培養(yǎng)液、10%胎牛血清及青霉素/鏈霉素雙抗進行重懸，并將細胞種植到未經(jīng)處理的聚苯乙烯培養(yǎng)皿上進行培養(yǎng)。培養(yǎng)液每2 d更換1次，當細胞融合達80%時，用0.25% Trypsin-EDTA酶消化進行傳代。本次試驗均采用4 ～ 5代的細胞。

3 3D間充質(zhì)干細胞培養(yǎng) 選擇一致的間充質(zhì)干細胞株復蘇后進行懸滴法三維培養(yǎng)[22]：復蘇后的細胞以懸滴形式種于培養(yǎng)皿上，每一懸滴含有DMEM培養(yǎng)液、10%胎牛血清及2×104個細胞，培育36 h。然后將成球的細胞聚集體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上再次培育24 h。用0.25%的Trypsin-EDTA酶消化球形體細胞4 ～ 6 min，同時每2 ～ 3 min輕柔吹打1次以獲得單個的間充質(zhì)干細胞。

4 形態(tài)學觀察 自細胞培養(yǎng)起，分別在第1、4、7天應用普通倒置光學顯微鏡對細胞的生長、形態(tài)等情況進行動態(tài)追蹤觀察，對比兩組細胞的形態(tài)學改變。

5 細胞直徑測量 細胞培養(yǎng)72 h后，用0.25%Trypsin-EDTA酶對兩組細胞進行消化后重懸，在倒置光學顯微鏡下觀察并拍照，所得圖片用Image J (NIH)軟件測量細胞直徑(每個視野下測量100個細胞的直徑，取其平均值)。

6 流式細胞術(shù)進行細胞存活率檢測 分別收集2D與3D間充質(zhì)干細胞約2×105個，用Annexin V-FITC與PE細胞凋亡試劑盒進行染色，計算Annexin V-FITC/PE陽性細胞比例，從而進行細胞存活率檢測。

7 實時定量PCR(RT-PCR)檢測抗炎因子(IL-4，IL-10，IL-11及IL-13)和重要生長因子(VEGF和NT-3)的表達 按照說明書，用TRIzol試劑進行兩組細胞的總RNA抽提。用SuperscriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶和寡核苷酸引物(dT)合成一條cDNA鏈，并將其儲存于-20℃。應用SYBR Green實時PCR Master Mix進行RT-PCR過程。選擇等量的GAPHD作為內(nèi)參，所得數(shù)據(jù)用2-△△Ct進行標準化分析。所設計的引物見表1。

8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血管源性生長因子VEGF的表達 2D和3D細胞以同等密度水平種植在六孔中，加入DMEM培養(yǎng)24 h，收集其培養(yǎng)基，離心并儲存在-80℃。用酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒測定血管源性生長因子多肽(VEGF)濃度。

9 統(tǒng)計學分析 用SPSS17.0進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 RT-PCR所需引物的序列Tab. 1 Prime sequences for RT-PCR

圖 1 2D和3D間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學觀察A為普通貼壁培養(yǎng)第7天的形態(tài)，細胞伸長呈長梭形； B為三維培養(yǎng)的細胞第7天的形態(tài)，可見3D間充質(zhì)干細胞呈明顯的球形聚集生長。二者均未見到明顯衰老壞死的細胞Fig. 1 Morphological observation of 2DMSCs vs 3DMSCs A: the morphology of 2DMSCs at the 7th day.Cells grew as the spindle-shape; B: 3DMSCs were more likely to grow as a spheroid. There was no obvious senescent or necrosis cell in both of them

圖2 兩組細胞存活率的流式細胞測定A：2D細胞存活率為96%； B：3D細胞存活率為91.6%Fig. 2 Comparison of survival rate between two groups The survival rate of 2DMSCs was 96%, while the survival rate of 3DMSCs was 91.6%

圖3 兩組細胞直徑比較 A：2D細胞； B：3D細胞； C：3D細胞的直徑顯著低于2D細胞Fig. 3 Comparison of cell size of two groups. Panel A and panel B were the representative picture of 2DMSCs and 3DMSCs under a standard microscopy, respectively. Panel C showed that the average cell size of 3DMSCs was smaller

結(jié) 果

1 細胞形態(tài)學觀察 2D間充質(zhì)干細胞在原代培養(yǎng)3 ～ 4 h開始貼壁，24 h左右細胞呈完全貼壁生長，7 d時細胞融合達80 ～ 90%，光學顯微鏡下可觀察到呈均一長梭形的間充質(zhì)干細胞(圖1A)；懸滴法培養(yǎng)的3D間充質(zhì)干細胞，則表現(xiàn)為聚集成球生長(圖1B)。兩組細胞大部分生長完好，很少見到衰老死亡的細胞。

2 細胞存活率的比較 經(jīng)過Annexin-V FITC染色后，流式細胞儀結(jié)果顯示2D與3D間充質(zhì)干細胞存活率分別為96%、91.6%(P=0.234)，差異無統(tǒng)計學意義(圖2)。

3 細胞直徑比較 2D間充質(zhì)干細胞平均直徑為16.31μm，3D間充質(zhì)干細胞的平均直徑為10.15μm，減少了37.8%(P＜0.001)。見圖3。

4 細胞因子分泌能力比較 與2D間充質(zhì)干細胞相比，3D間充質(zhì)干細胞的VEGF、NT-3、IL-4、IL-10、IL-11、IL-13的mRNA表達水平明顯上升(P均＜0.05)。見圖4。

圖4 IL-4、 IL-10、 IL-11、 IL-13、 VEGF及NT3 mRNA表達水平比較Fig. 4 Comparison of IL IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, VEGF and NT3 at mRNA level between 2DMSCs and 3DMSCs

5 血管源性生長因子蛋白表達比較 ELISA法結(jié)果顯示，與2D細胞相比，3D細胞的VEGF的表達量顯著升高(P=0.002)。見圖5。

圖5 ELISA結(jié)果顯示，3D間充質(zhì)干細胞的VEGF的表達顯著高于2D間充質(zhì)干細胞Fig. 5 ELISA results showed that the protein level of VEGF was highly expressed in 3DMSCs when compared to 2DMSCs

討 論

目前體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的經(jīng)典方式仍然是傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)。這種培養(yǎng)方式因操作簡便、能夠短時間內(nèi)擴增獲得足夠數(shù)量的細胞等優(yōu)點，受到廣泛的青睞。然而，這種二維貼壁培養(yǎng)的微環(huán)境與該細胞在原代分離前所處的微環(huán)境相差甚遠，使得所培養(yǎng)干細胞的生物學特性難以維持，導致分化潛能降低、增殖性細胞老化及旁分泌功能受損等[25-27]。因此，探索可替代、不明顯影響細胞生物學特征的培養(yǎng)方式勢在必行。

相比于傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)，以三維立體的方式進行培養(yǎng)能夠更好地模擬體內(nèi)生理環(huán)境，減少對細胞生物學特征的影響。目前對三維培養(yǎng)方式的構(gòu)建，大多研究依賴研發(fā)的新型支架材料，如Zhou等[28]使用豬真皮基質(zhì)作為支架進行人間充質(zhì)干細胞三維培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細胞的遷移歸巢能力得到明顯提升；Fagihihi等[29]應用明膠材料作為支架進行三維培養(yǎng)，使得間充質(zhì)干細胞的分化潛能明顯提高。但是，生物或人工材料的應用會明顯限制間充質(zhì)干細胞的應用范圍，尤其是臨床的細胞移植治療，因為材料終究是異物，會帶來相應的免疫排斥反應，加之材料會占據(jù)相當?shù)目臻g，易引起血管堵塞等問題。

本次研究采用改良的懸滴法進行人胎盤間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)，該方法無需任何體外的支架材料，即可營造三維的培養(yǎng)環(huán)境，具備高效率、低成本等優(yōu)點。培養(yǎng)所得細胞在形態(tài)學上表現(xiàn)為大小均一，呈三維球形生長。同時，我們對比了3D和2D間充質(zhì)干細胞的直徑，結(jié)果表明3D的間充質(zhì)干細胞的直徑明顯減小。這一點尤其重要，因為目前臨床上最常用的細胞移植方式為血管內(nèi)注射移植[30]，細胞較大常會引起血管堵塞，不僅影響療效，還會導致嚴重不良反應，如肺栓塞、缺血性腦梗等。這為后期3D間充質(zhì)干細胞的臨床移植治療提供便利。

大量研究表明，間充質(zhì)干細胞發(fā)揮治療的效應主要通過其旁分泌效應而非細胞替代作用[31]。其旁分泌效應又是通過釋放營養(yǎng)因子和抗炎因子實現(xiàn)。因此，我們進一步對比了3D與2D間充質(zhì)干細胞的旁分泌功能。研究表明，在mRNA水平上，前者的VEGF、NT-3以及多種抗炎因子IL-4、IL-10、IL-11、IL-13的水平顯著高于2D間充質(zhì)干細胞；為進一步確定某些因子在蛋白質(zhì)水平上的表達，我們選擇性地檢測了VEGF的表達，因為該種細胞因子對創(chuàng)傷的修復以及血管的再生具有重要作用。結(jié)果表明，3D間充質(zhì)干細胞的VEGF表達明顯高于2D間充質(zhì)干細胞。我們也應用流式細胞術(shù)檢驗了兩組細胞的存活率，結(jié)果表明經(jīng)過三維處理的3D細胞與2D細胞在存活率上無統(tǒng)計學差異。

本次研究也存在一定的局限性，我們盡管從多個方面觀察到三維培養(yǎng)的優(yōu)點，但其優(yōu)勢的具體機制仍不得而知，仍需進一步開展相關(guān)實驗進行研究。另外，相比于2D間充質(zhì)干細胞，3D間充質(zhì)干細胞某些重要因子的表達反而下降，如腦源性生長因子多肽(該因子在神經(jīng)損傷修復中發(fā)揮重要作用，相關(guān)數(shù)據(jù)未發(fā)表)。

綜上所述，本實驗對比了改良懸滴法培養(yǎng)的3D間充質(zhì)干細胞與傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)的2D間充質(zhì)干細胞，發(fā)現(xiàn)3D間充質(zhì)干細胞在分泌營養(yǎng)因子及抗炎能力上要明顯強于2D間充質(zhì)干細胞，而更小的細胞直徑使其在未來的臨床應用上有良好前景，為3D間充質(zhì)干細胞的下一步動物及臨床實驗奠定了基礎(chǔ)。