川芎嗪通過(guò)抗氧化及抗炎作用改善脊髓損傷

都芳濤，方繼峰，李興晶，喬培柳，李廣義

(山東泰山醫(yī)學(xué)院附屬聊城市第二人民醫(yī)院骨外科，山東 臨清 252600)

脊髓損傷可導(dǎo)致四肢及軀體受損部位功能障礙，導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥，包括骨髓水腫與受損部位的細(xì)胞凋亡，甚至終生殘疾及死亡[1]，這種損傷包括急性損傷與二次損傷。急性脊髓損傷可導(dǎo)致脊髓部分或全部破裂[2-3]。原發(fā)性脊髓損傷可降解關(guān)鍵的細(xì)胞骨架及活性功能蛋白，導(dǎo)致病變部位及其周圍神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的遲發(fā)性死亡[4-5]。原發(fā)性損傷是機(jī)械損傷，是不可避免的[6]，而二次損傷可通過(guò)干預(yù)進(jìn)行避免[7]。大量研究都致力于了解脊髓二次損傷的機(jī)理，以達(dá)到開(kāi)發(fā)出可以改善甚至是逆轉(zhuǎn)脊髓損傷的治療方法。川芎嗪是中藥川芎中的生物堿，有擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集的作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可以減輕腦損傷、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[9]。另外，川芎嗪可以抑制淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)及促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的表達(dá)，降低炎癥相關(guān)的信號(hào)分子和細(xì)胞核因子κB的活性，促進(jìn)缺血神經(jīng)元和巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)核因子E2 、相關(guān)因子2(Nrf2)和血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達(dá)，發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。然而，川芎嗪針對(duì)脊髓損傷的作用機(jī)理大部分處于未知狀態(tài)。本研究主要是通過(guò)對(duì)照研究川芎嗪對(duì)脊髓損傷的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)川芎嗪可能通過(guò)提高Nrf2-GCLc/GCLm信號(hào)通路促進(jìn)脊髓損傷的康復(fù)，從而改善氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)脊髓功能的恢復(fù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2017年1月—2018年5月在我院治療的90例脊髓損傷患者，46名男性和44名女性；年齡45～67歲，平均(55.56±9.54)歲。分為對(duì)照組、高劑量川芎嗪組和低劑量川芎嗪組，平均每組30人，兩組間性別、年齡無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 患者一般情況比較

1.2 分組與給藥

對(duì)照組患者在治療過(guò)程中靜脈滴注250 mL 0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)靜滴14 d。高劑量川芎嗪組病例靜脈滴注250 mL 0.9%氯化鈉注射液+240 mg川芎嗪，連續(xù)靜滴14 d。低劑量川芎嗪組病例靜脈滴注250 mL 0.9%氯化鈉注射液+120 mg川芎嗪，連續(xù)靜滴14 d。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR

患者靜脈滴注療程結(jié)束后進(jìn)行腰椎穿刺抽取腦脊液進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)(天根生化科技北京有限公司)，采用Trizol法提取總RNA。并對(duì)cDNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，而后采用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行樣品分析(BIORAD CFX96實(shí)時(shí)平臺(tái)，SYBR Premix Ex TaqTM II)?；虻谋磉_(dá)歸一化到β-肌動(dòng)蛋白水平，并采用2-△△Ct進(jìn)行對(duì)比分析。

1.4 促炎性細(xì)胞因子的生化檢測(cè)

抽取患者腦脊液后根據(jù)廠家的說(shuō)明書(shū)，采用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定其中的IL-1β、TNF-α、Nrf2及GCLc與GCLm的含量(BioVision公司)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 川芎嗪對(duì)炎癥反應(yīng)的作用

炎癥反應(yīng)與脊髓損傷的病情發(fā)展密切相關(guān)，研究顯示抗炎作用能改善脊髓損傷[10-12]。本次研究中，我們?cè)u(píng)估了川芎嗪對(duì)脊髓損傷患者體內(nèi)炎癥的作用。如表2所示，與對(duì)照組患者相比，給予川芎嗪靜滴的脊髓損傷患者的腦脊液中的TNF-α與IL-1β的mRNA表達(dá)明顯降低。

表2 川芎嗪對(duì)TNF-α和IL-1β含量的影響

2.2 川芎嗪對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)主要調(diào)節(jié)因子的作用

脊髓損傷患者體內(nèi)Nrf2(一種重要的氧化還原控制因子)的mRNA表達(dá)顯著降低。攝入川芎嗪可以顯著抑制脊髓損傷患者體內(nèi)Nrf2的表達(dá)降低。另外，GCLc與GCLm的mRNA表達(dá)在挫傷性脊髓損傷后顯著下調(diào)。川芎嗪可以顯著上調(diào)GCLc與GCLm的mRNA表達(dá)。見(jiàn)表3。

表3 川芎嗪對(duì)Nrf2、GCLc、GCLm含量的影響

3 討論

川芎嗪主要成分為2，3，5，6-四甲基吡嗪，是從川芎根莖中提取分離的生物堿單體，有促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，減輕腦損傷的作用[10]，該物質(zhì)可能存在保護(hù)神經(jīng)及促進(jìn)神經(jīng)元再生的作用，但目前關(guān)于川芎嗪對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)元再生的作用機(jī)理的研究較少。此次研究中，我們抽取脊髓損傷患者腦脊液進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定和促炎性細(xì)胞因子的生化檢測(cè)，以此評(píng)估川芎嗪對(duì)脊髓損傷恢復(fù)作用過(guò)程中抗氧化及抗炎癥活性的作用。

炎癥反應(yīng)與脊髓損傷的病情發(fā)展密切相關(guān)，降低炎癥反應(yīng)可以改善脊髓損傷，促進(jìn)脊髓的恢復(fù)[11-12]。有研究表明，脊髓損傷后IL-1β含量上升是慢性損傷的重要信號(hào)[13]。脊髓損傷的炎癥反應(yīng)與TNF-α相關(guān)聯(lián)，其表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可抑制脊髓損傷過(guò)程中炎性反應(yīng)，主要通過(guò)IL-1β與TNF-α的表達(dá)反映出來(lái)。先前研究表明川芎嗪可以抑制大鼠急性損傷后脊髓組織中巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子、NF-Kβ及IL-1β的表達(dá)，阻止白細(xì)胞的浸潤(rùn)，促進(jìn)NF-Kβ抑制蛋白和抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，達(dá)到減輕急性脊髓損傷后炎癥反應(yīng)的目的[11]。川芎嗪還能抑制脊髓損傷小鼠脊髓組織TNF-α、IL-1β和COX-2的mRNA的表達(dá)，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，延遲脊髓繼發(fā)性損傷和保護(hù)脊髓[9]。川芎嗪無(wú)論劑量大小均可降低腦缺血組織中EDI、IL-1β和TNF-α的表達(dá)，抑制缺血區(qū)的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)腦組織[16]。結(jié)合以上結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，川芎嗪的抗炎作用可能與脊髓損傷的恢復(fù)有關(guān)。在本研究中，通過(guò)利用在治療脊髓損傷患者過(guò)程中靜滴川芎嗪探討患者腦脊液中炎性因子的表達(dá)中發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷患者在給予靜滴川芎嗪后TNF-α和IL-1β的表達(dá)明顯下降，川芎嗪對(duì)于減輕脊髓損傷具有重要作用。

氧化應(yīng)激反應(yīng)可以影響脊髓損傷的發(fā)病及發(fā)展[17]。川芎嗪通過(guò)抗氧化、抗凋亡等途徑對(duì)腦組織進(jìn)行保護(hù)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[18]，川芎嗪可通過(guò)提高核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)和谷氨酰半胱氨酸鏈接酶(GCLc)的蛋白表達(dá)，促進(jìn)谷胱甘肽的合成，降低ROS水平，阻斷細(xì)胞凋亡，恢復(fù)線粒體功能，改善氯化鈷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和腦神經(jīng)損傷，達(dá)到保護(hù)腦神經(jīng)的作用。川芎嗪還可提高Nrf2和GCLc的表達(dá)抑制MPTP誘導(dǎo)的大鼠大腦黑質(zhì)氧化應(yīng)激損傷[19]。與既往研究不同，此次研究通過(guò)針對(duì)脊髓損傷患者治療過(guò)程中靜滴川芎嗪，抽取腦脊液測(cè)定相關(guān)因子的PCR表達(dá)，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激相關(guān)因子，例如Nrf2、GCLc、GCLm的mRNA表達(dá)明顯增加，大劑量應(yīng)用川芎嗪的脊髓損傷患者增加更為明顯，成正相關(guān)性，這說(shuō)明川芎嗪對(duì)于脊髓損傷患者的氧化應(yīng)激反應(yīng)有重要作用，這對(duì)于以后在臨床上應(yīng)用川芎嗪治療脊髓損傷患者提供了新的方向。

另外，臨床藥理實(shí)驗(yàn)證明，川芎嗪具有抗血小板聚集作用，可改善微循環(huán)，抗氧化、抗纖維化和拮抗Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[20-23]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，川芎嗪可降低缺血再灌注后大腦皮質(zhì)腫瘤壞死因子-α含量和髓過(guò)氧化物酶活性，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)腦缺血大鼠的腦神經(jīng)[24]。此次研究我們進(jìn)一步驗(yàn)證：川芎嗪可改善氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，降低脊髓損傷，促進(jìn)脊髓損傷患者的恢復(fù)，這些結(jié)果為川芎嗪治療相關(guān)的脊髓損傷與神經(jīng)退行性疾病提供了新的視角。