茍小軍，馮琴，胡義揚#

（1.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中心實驗室，上海 201999；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院/上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所，上海 201203）

隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，非酒精性脂肪肝（NAFLD）的發(fā)病率逐年升高，已成為全球性醫(yī)療和公共衛(wèi)生問題[1-3]。NAFLD現(xiàn)已成為西方發(fā)達(dá)國家人群患慢性肝病和肝功能異常的主要原因之一，其在普通人群中的發(fā)病率一般約為20%～33%；大約50%的NAFLD患者在患病4～13年后發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎，40%發(fā)展為肝纖維化[4-5]。在過去20年中，亞洲國家NAFLD發(fā)病率持續(xù)上升，并且已呈年輕化趨勢；在我國，NAFLD的成人發(fā)病率可達(dá)15%，在經(jīng)濟發(fā)達(dá)地區(qū)甚至更高[6]。

目前，臨床上主要應(yīng)用化學(xué)藥如胰島素增敏劑、降血脂藥等治療NAFLD，但這類藥物效果并不十分理想，且容易導(dǎo)致患者出現(xiàn)并發(fā)癥[7]。近些年來，中醫(yī)藥治療NAFLD開始引起人們的廣泛關(guān)注。許多中藥不僅具有良好的抗脂肪肝效果，而且毒副作用小、價格低廉、宜長期使用，在治療NAFLD方面顯示出良好的發(fā)展前景[8]。

祛濕化瘀方來源于臨床經(jīng)驗方，由茵陳、梔子等5味中藥組成，在動物實驗中多次證實，該方對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型大鼠有明顯的治療作用，能夠改善肝臟脂肪代謝，降低肝臟中三酰甘油（TG）和游離脂肪酸的含量[9]。但是在代謝水平上，祛濕化瘀方治療NAFLD的具體作用機制還未闡明，尤其該方對NAFLD模型大鼠血清中不同類型的游離脂肪酸的影響尚未見報道。因此，本研究通過高脂飲食誘導(dǎo)建立NAFLD大鼠模型，考察祛濕化瘀方對模型大鼠血清游離脂肪酸譜的影響，為臨床有效治療NAFLD及更全面、深入地闡明該方的作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

7890A/5975C型氣相色譜（GC）-質(zhì)譜（MS）聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；H1650-W型冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；IX71型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；QL-86型旋渦混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；TP-220型電子天平（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

祛濕化瘀方藥液由上海中醫(yī)藥大學(xué)科技中心制備，冷藏備用[該方所用藥材茵陳、虎杖、田基黃、姜黃、生山梔均購自上海華宇藥業(yè)有限公司，有明確的原產(chǎn)地，經(jīng)生藥學(xué)專家鑒定均為真品。上述藥材按4∶4∶3∶2∶2的質(zhì)量比配伍；茵陳、虎杖、姜黃以75%乙醇提取3次，濾過，回收乙醇，留取藥液；生山梔、田基黃進行水提醇沉處理；合并上述藥液，濃縮，使終質(zhì)量濃度為0.93 g/mL（按生藥計）]。

含37種脂肪酸甲酯的混合對照品試劑盒（美國Sigma公司，其具體組成見表1）；1%水楊酸甲酯溶液[內(nèi)標(biāo)，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：119-36-8]；正己烷、硫酸、甲醇等試劑均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；實驗用水為超純水。

1.3 動物

SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量（170±20）g，清潔級，購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（滬）2003-0002。大鼠在上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心清潔級動物房中飼養(yǎng)與實驗，期間自由飲水。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按計算機隨機數(shù)字表分為正常組、模型組、祛濕化瘀方組，每組10只。模型組和祛濕化瘀方組大鼠飼喂高脂飼料（普通飼料+2%膽固醇+10%豬油）8周，建立NAFLD模型；正常組大鼠飼喂普通飼料8周。參照文獻(xiàn)[9]方法，自第5周起，祛濕化瘀方組大鼠按0.1 mL/kg灌胃祛濕化瘀方藥液（相當(dāng)于體質(zhì)量60 kg成人的10倍劑量），正常組和模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，連續(xù)給藥4周。

2.2 標(biāo)本留取

在飼喂第8周結(jié)束時，稱定大鼠體質(zhì)量，按3 mL/kg腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液進行麻醉；打開大鼠腹腔，從下腔靜脈收集血液并于4℃靜置2 h，3 000 r/min離心15 min后，吸取上層血清于－70℃冷凍保存待測；剖取肝臟，取肝右葉部分組織，以10%中性福爾馬林溶液固定，用于病理學(xué)檢查。

表1 含37種脂肪酸甲酯對照品的混合標(biāo)準(zhǔn)試劑盒組成Tab 1 Composition of mixed standard reagent kit containing 37 kinds of reference substance of fatty acid methyl ester

2.3 肝組織病理學(xué)檢查

取“2.2”項下固定后的肝組織，脫水，石蠟包埋，按4 μm厚度切片。然后進行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，于倒置顯微鏡下觀察，并依據(jù)《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[10]，判定肝細(xì)胞脂肪變性程度。

2.4 血清游離脂肪酸的檢測

2.4.1 溶液的制備 取含37種脂肪酸甲酯對照品的混合標(biāo)準(zhǔn)試劑適量，用正己烷配制成總成分質(zhì)量濃度為1 000、500、100、50、10、1 mg/L的系列混合對照品溶液；另外，直接將1%水楊酸甲酯溶液以正己烷稀釋至500 μg/mL，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4.2 血清樣本預(yù)處理（脂肪酸甲酯化衍生反應(yīng)） 取大鼠血清樣本50 μL，加入1%硫酸甲醇溶液2 mL，于80℃水浴中放置30 min，進行甲酯化反應(yīng)；然后加入正己烷1 mL，渦旋30 s萃取，靜置分層；分取有機相，加水5 mL洗滌，再加正己烷1 mL，渦旋30 s萃取，合并有機相，靜置分層；吸取有機相上層清液300 μL，加內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，混勻后進樣測定。

2.4.3 色譜與質(zhì)譜條件 （1）色譜條件：色譜柱為Agilent DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣量為1 μL，分流進樣（分流比10∶1）；進樣口溫度為280℃；離子源溫度為230℃；傳輸線溫度為250℃；色譜柱程序升溫（起始溫度50℃，保持3 min；以10℃/min升至220℃，保持20 min）；載氣為氦氣，載氣流速為1.0 mL/min。（2）質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源（ESI）；選擇離子掃描（SIM）模式；電子能量為70 eV。

2.4.4 方法學(xué)考察 對所建立的GC-MS法進行方法學(xué)考察。（1）線性關(guān)系：取1 000、500、100、50、10、1 mg/L的系列混合對照品溶液各適量，分別加入內(nèi)標(biāo)溶液適量，按“2.4.3”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣測定。以混合對照品中各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、各組分與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)，進行線性回歸分析，結(jié)果相關(guān)系數(shù)均大于0.99，表明線性關(guān)系良好。（2）精密度：取500 mg/L的混合對照溶液連續(xù)進樣6次，結(jié)果各組分峰面積的RSD在0.99%～7.89%之間，表明儀器精密度良好。（3）定量限：取10 mg/L的混合對照溶液連續(xù)進樣6次，以6次測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差的10倍作為本方法的定量限，結(jié)果各組分的定量限在0.013～0.87 mg/L之間，表明本方法的靈敏度能夠滿足分析要求。

基于所建分析方法，對含37種脂肪酸甲酯的混合對照品進行檢測，結(jié)果共獲得32種脂肪酸甲酯峰（其中，C4：0、C18：1N9T、C18：2N6T、C20：3N6、C24：1未能檢出），總離子流色譜圖見圖1。由圖1可見，各脂肪酸甲酯組分之間及與內(nèi)標(biāo)（IS）之間均能實現(xiàn)良好分離，表明本方法可靠。

2.4.5 血清樣本中游離脂肪酸含量測定 取大鼠血清樣本50 μL，按“2.4.2”項下方法預(yù)處理，并按“2.4.3”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣測定，再按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算其中游離脂肪酸含量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)運用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，采用t檢驗進行組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果

顯微鏡下可見，正常組大鼠肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，未見脂肪樣變性等異常變化；與正常組比較，模型組大鼠肝組織多發(fā)壞死肝細(xì)胞，并有多處壞死灶，壞死區(qū)有炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪樣變性和空泡變性；與模型組比較，祛濕化瘀方組大鼠肝細(xì)胞的脂肪樣變性和腫脹程度明顯減輕，壞死減少，炎癥細(xì)胞浸潤情況亦減少。各組大鼠肝組織病理學(xué)變化顯微圖見圖2。

圖1 總離子流色譜圖Fig 1 Total ion chromatogram

圖2 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化顯微圖（HE染色，×200）Fig 2 Micrographs of pathological change of liver tissue in rats of each group（HE staining，×200）

3.2 各組大鼠血清游離脂肪酸的組成與含量比較

各組大鼠血清飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸含量測定結(jié)果見表2、表3。分別對測得的32種血清游離脂肪酸含量按照飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸進行分類統(tǒng)計，結(jié)果見表4（其中，C6：0、C8：0、C10：0、C11：0、C13：0、C14：1、C15：1、C16：1、C20：5N3、C20：2、C22：2、C23：0在血清中含量太低，只有個別大鼠能檢測到，因此未能納入統(tǒng)計）。

由表2、表3可見，與正常組比較，模型組大鼠血清中C12：0（月桂酸）、C14：0（肉豆蔻酸）、C15：0（十五烷酸）、C16：0（棕櫚酸）、C17：0（十七烷酸）、C18：0（硬脂酸）、C20：0（花生酸）、C21：0（二十一烷酸）、C22：0（榆樹酸）等飽和脂肪酸含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C17：1（順-10-十七碳烯酸）、C18：1N9C（油酸）、C18：3N3（α-亞麻酸）、C18：3N6（γ-亞麻酸）、C22：1N9（芥酸）、C18：2N6C（亞油酸）、C20：1（順-11-二十碳烯酸）、C20：4（花生四烯酸）、C20：3N3（順-11，14，17-二十碳三烯酸）、C22：6N3（DHA）等不飽和脂肪酸含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。由表4可見，與正常組比較，模型組大鼠血清中總脂肪酸和飽和脂肪酸含量均顯著升高（P＜0.05），不飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量均顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清飽和脂肪酸含量測定結(jié)果（n＝10，μg/mL）Tab 2Results of serum contents of saturated fatty acid in rats of each group（n＝10，μg/mL）

由表2、表3可見，與模型組比較，祛濕化瘀方組大鼠血清中C12：0（月桂酸）、C14：0（肉豆蔻酸）、C15：0（十五烷酸）、C16：0（棕櫚酸）、C17：0（十七烷酸）、C18：0（硬脂酸）、C20：0（花生酸）、C21：0（二十一烷酸）、C22：0（榆樹酸）等飽和脂肪酸含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；C17：1（順-10-十七碳烯酸）、C18：1N9C（油酸）、C18：3N3（α-亞麻酸）、C18：3N6（γ-亞麻酸）、C22：1N9（芥酸）、C18：2N6C（亞油酸）、C20：1（順-11-二十碳烯酸）、C20：4（花生四烯酸）、C20：3N3（順-11，14，17-二十碳三烯酸）、C22：6N3（DHA）等不飽和脂肪酸含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。由表4可見，與模型組比較，祛濕化瘀方組大鼠血清中總脂肪酸和飽和脂肪酸含量均顯著降低（P＜0.05），不飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量均顯著升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清不飽和脂肪酸含量測定結(jié)果（n＝10，μg/mL）Tab 3Results of serum content of unsaturated fatty acid in rats of each group（n＝10，μg/mL）

表4 各組大鼠血清不同類別游離脂肪酸含量統(tǒng)計結(jié)果（n＝10，μg/mL）Tab 4Results of serum content of various free fatty acids in rats of each group（n＝10，μg/mL）

4 討論

NAFLD在古代中醫(yī)文獻(xiàn)中沒有記載，其病因（多為飲食不節(jié)、久坐少動、精神壓力大、過度肥胖）、病位（肝臟）和臨床表現(xiàn)涉及祖國醫(yī)學(xué)中“痰證”“濕阻”“脹滿”“積聚”“脅痛”等病證，因此可歸屬于中醫(yī)的“積證”“脅痛 ”“ 痰 證 ”“ 瘀 血 ”“ 黃 疸 ”“ 鼓 脹 ”“ 肝 痹 ”等 范 疇 。NAFLD發(fā)病與肝、脾、腎功能密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為肝失疏泄、肝血瘀滯，脾失健運、內(nèi)生濕濁以及腎精虧損等。中醫(yī)治療該病主要以清熱祛濕、疏肝理氣、健脾化痰、活血化瘀、補腎益精等法為主，兼顧虛實、寒熱、陰陽辨證用藥[11]。祛濕化瘀方是臨床經(jīng)驗方，具有清熱祛濕、活血化瘀的功效。以往的研究表明，該方對高脂飲食或四氯化碳聯(lián)合高脂低蛋白飲食誘導(dǎo)的脂肪肝模型大鼠具有明顯的保護和治療作用，能顯著降低TG、游離脂肪酸和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平，可改善肝臟脂肪樣變性和炎癥狀態(tài)[12-13]。本課題組前期對該方改善肝臟脂肪代謝、防治NAFLD的作用機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)該方能通過干預(yù)“脂聯(lián)素-游離脂肪酸代謝”路徑，來調(diào)節(jié)單磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）活性及其相關(guān)靶蛋白活性，降低肝組織游離脂肪酸水平，從而減輕肝臟中脂質(zhì)的過度沉積[9-10]。

脂肪酸根據(jù)碳鏈上是否包含雙鍵分為不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸；不飽和脂肪酸進一步根據(jù)碳鏈上雙鍵的數(shù)量分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸；根據(jù)碳鏈上雙鍵的位置又可將多不飽和脂肪酸分為ω-3多不飽和脂肪酸、ω-6多不飽和脂肪酸、ω-9多不飽和脂肪酸等[14]。本研究結(jié)果顯示，NAFLD模型大鼠血清中月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸、二十一烷酸、榆樹酸等飽和脂肪酸含量均顯著升高，這與高脂飲食攝入和機體內(nèi)分泌代謝紊亂有關(guān)。高脂飲食中的豬油富含飽和脂肪酸，特別是棕櫚酸的含量較高[15]，不僅可增加血液中游離脂肪酸含量，還可引起胰島素抵抗[16]。已有研究證明，飽和脂肪酸能降低胰島素敏感性，可作為配體直接激活Toll樣受體4（TLR4）信號通路并促進TNF-α、白細(xì)胞介素6（IL-6）等炎癥因子的釋放，誘導(dǎo)慢性炎癥的發(fā)生，并加重胰島素抵抗（IR）[17]。游離脂肪酸通常積聚在肝臟中，當(dāng)機體攝入高脂飲食或脂肪組織功能異常、無法儲存脂質(zhì)時，過量的脂質(zhì)會直接進入并蓄積于肝臟，引發(fā)肝臟炎癥和NAFLD[18]。

本研究結(jié)果顯示，NAFLD模型大鼠血清中順-10-十七碳烯酸、油酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、芥酸、亞油酸、順-11-二十碳烯酸、花生四烯酸、順-11，14，17-二十碳三烯酸、DHA等不飽和脂肪酸含量均顯著降低。據(jù)報道，富含單不飽和脂肪酸的橄欖油可以降低高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖模型小鼠的體質(zhì)量，降低血清TG和轉(zhuǎn)氨酶水平，并顯著降低肝臟脂肪含量；同時，單不飽和脂肪酸可降低糖尿病患者的血清低密度脂蛋白（LDL）、TG和空腹血糖（FBG）水平，并使高密度脂蛋白（HDL）明顯升高[19-20]。ω-3多不飽和脂肪酸參與了血糖控制過程，對IR和NAFLD有明顯影響，其缺乏將伴隨胰島素敏感性改變及脂肪病變[21]。此外，胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常和脂肪代謝失衡是脂肪肝形成的主要原因之一，飲食中的不飽和脂肪酸可以調(diào)節(jié)與葡萄糖代謝有關(guān)的酶和激素如α-淀粉酶、麥芽糖酶、胰島素、瘦素等的水平，從而降低血糖，改善胰島素敏感性，減輕IR[14]。已有研究發(fā)現(xiàn)，富含多不飽和脂肪酸如α-亞麻酸、亞油酸、花生四烯酸等的食物可以抑制肝細(xì)胞中的脂肪積聚，這一作用可能是通過上調(diào)脂肪酸β氧化、?；o酶A氧化酶和中鏈酰基輔酶A脫氫酶基因表達(dá)，下調(diào)膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP-1c）表達(dá)，減輕IR等機制實現(xiàn)的[22-24]。

本實驗中的模型組大鼠血清中飽和脂肪酸含量顯著升高，不飽和脂肪酸含量顯著降低，提示當(dāng)發(fā)生NAFLD時機體同時發(fā)生了脂肪酸紊亂，而脂肪酸紊亂會導(dǎo)致肝內(nèi)脂質(zhì)過度沉積，進一步加重脂肪肝組織病變[25]。而采用祛濕化瘀方干預(yù)后，模型大鼠肝組織病理學(xué)變化明顯改善；且經(jīng)GC-MS法測定結(jié)果證實，祛濕化瘀方干預(yù)能顯著改善模型大鼠血清中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量的異常變化，調(diào)節(jié)紊亂的游離脂肪酸譜趨于正常。

綜上，筆者認(rèn)為當(dāng)高脂飲食導(dǎo)致大鼠發(fā)生NAFLD時，血清飽和脂肪酸含量的升高和不飽和脂肪酸含量的降低既是NAFLD的作用結(jié)果，也是促進NAFLD發(fā)展的因素。NAFLD模型大鼠血清中存在明顯的游離脂肪酸譜紊亂，而不同類型的脂肪酸在NAFLD的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著不同的作用。其中ω-3多不飽和脂肪酸（如α-亞麻酸、DHA等）具有明顯的抗炎和改善脂質(zhì)代謝作用，并能顯著改善NAFLD模型大鼠肝脂肪樣變性，減輕肝組織炎癥反應(yīng)。建議通過膳食補充ω-3多不飽和脂肪酸或采用祛濕化瘀方等藥物干預(yù)脂肪酸代謝，從而有效預(yù)防和治療NAFLD。