任丹君，丁一，丁笑剛，翟文杰，劉文星，劉天龍，李建光

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，西安 710032；3.晉中市第一人民醫(yī)院藥劑科，山西 晉中 030600）

近年來，腦血管疾病已成為危害人類健康的重大疾病之一，其中缺血性腦卒中是人類致殘、致死的重要原因[1]。治療性血管新生在缺血性疾病的發(fā)生、治療及預(yù)后中均發(fā)揮著重要的作用，是目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[2]。血管新生一方面可為缺血區(qū)域提供大量生長因子以增加微血管循環(huán)；另一方面亦可促進(jìn)神經(jīng)及突觸再生，并為突觸可塑性的調(diào)控提供營養(yǎng)和氧氣，因而被認(rèn)為是缺血性腦卒中后康復(fù)的核心治療策略[3]。相關(guān)研究證實(shí)，中藥及民族藥在腦缺血性疾病的治療中發(fā)揮著舉足輕重的作用[4-5]。訶子為使君子科植物訶子（Terminalia chebulaRetz.）或絨毛訶子（T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.）的干燥成熟果實(shí)。在藏藥經(jīng)典著作《晶珠本草》中，訶子被稱為“藏藥之王”，有“補(bǔ)隆”之效[6]，且藏醫(yī)“補(bǔ)隆養(yǎng)血”與治療性血管新生理論相似[7]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，訶子提取物具有抗氧化、促進(jìn)血管新生等作用，已有研究初步證實(shí)訶子提取物的腦保護(hù)作用[8]。對(duì)于訶子有效成分在心腦血管疾病中的研究多集中在其抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血脂等[9-11]作用上，然而其是否能通過促進(jìn)血管新生這一機(jī)制來發(fā)揮腦保護(hù)作用卻鮮有報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，訶子中多酚類活性成分鞣花酸可改善動(dòng)脈粥樣硬化[12]；其另一種多酚類活性成分柯里拉京可調(diào)控核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）通路，發(fā)揮抗氧化、抗炎、促血管新生的作用，緩解大鼠腦缺血再灌注損傷[9]?；谝陨媳尘埃狙芯客ㄟ^建立腦缺血再灌注[即大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）再灌注]損傷大鼠模型，觀察訶子提取物對(duì)模型大鼠腦組織的保護(hù)作用，進(jìn)一步探討其通過調(diào)控VEGF/血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（VEGFR2）通路和調(diào)節(jié)一氧化氮（NO）水平進(jìn)而抗腦缺血再灌注損傷的可能機(jī)制，為訶子提取物用于腦缺血再灌注損傷的防治提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HX-100E型小動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）；COOLPIX S1型照相機(jī)（日本Nikon公司）；Ⅸ71-Dtr/2型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；SCIENTZ-10N型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；403756PK5Re型線栓（美國Doccol公司）；037-003型大鼠腦槽（北京華越洋生物科技有限公司）；HM340E型石蠟切片機(jī)（德國Zeiss公司）；Multiskan GO型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；5804R型低溫冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司，離心半徑：16.8 cm）；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2 藥材與試劑

訶子粉[購于西安金綠生物工程技術(shù)有限公司，批號(hào)：20150401，規(guī)格：10∶1（生藥質(zhì)量∶訶子粉質(zhì)量）]，經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院文愛東教授鑒定為使君子科植物訶子（T.chebulaRetz.）果實(shí)的粉末。

VEGF、VEGFR2檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)分別為20151104、EK1525）；NO檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20151109）；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CD31抗體（FITC-CD31）、藻紅蛋白標(biāo)記的CD34抗體（PE-CD34）、FITC標(biāo)記的葡聚糖（FITC-D）（美國Abcam公司，批號(hào)分別為2530-1、553729、952964）；牛血清白蛋白（BSA，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：03J10150）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色劑、PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠免疫球蛋白G（PE-IgG）二抗、FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠免疫球蛋白G（FITC-IgG）二抗（美國Sigma公司，批號(hào)分別為32016D0、20172537、20171508）；多聚甲醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；蘇木精染料（上海化學(xué)試劑總廠試劑三廠）；伊紅染料（武漢博士德生物工程有限公司）；10%水合氯醛（空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科配制）；磷酸鹽緩沖液（PBS，空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科配制，pH 7.4）；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，7～8周齡，體質(zhì)量250～300 g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（軍）2012-007]。所有大鼠均分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為24～26℃，濕度為60%～70%；造模前均禁食、不禁水12 h。

2 方法

2.1 訶子提取物的制備

參考文獻(xiàn)[13]制備訶子提取物。稱取訶子粉適量，用適量60%乙醇加熱回流提取3次，合并提取液濃縮至約藥材量的一半，再加入等體積的95%乙醇，攪拌均勻，靜置12 h后，濾過，濾渣用60%乙醇洗滌，合并濾液與洗液，減壓回收乙醇，冷凍干燥后即得訶子提取物（每1 g提取物由2 g訶子粉制得），備用。

2.2 MCAO再灌注模型的建立

參照改良Longa線栓法[14-15]復(fù)制MCAO再灌注損傷模型。大鼠術(shù)前禁食12 h后，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，以仰臥位固定，沿頸正中線作縱行切口，分離皮下組織，結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，將線栓沿頸總動(dòng)脈分叉部約4 mm處插入頸總動(dòng)脈，直至有輕微阻力為止，造成右側(cè)大腦MCAO；缺血1.5 h后，拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注（當(dāng)大鼠清醒后，出現(xiàn)對(duì)側(cè)上肢重于下肢的癱瘓癥狀即視為造模成功）[16]。假手術(shù)組大鼠除不插入線栓外，其余操作同上。

2.3 分組與給藥

將40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和訶子提取物低、中、高劑量組（20、50、100 mg/kg，以提取物質(zhì)量計(jì)，劑量設(shè)置參考文獻(xiàn)[17-18]），每組8只。按“2.2”項(xiàng)下方法造模成功2 h后，各給藥組大鼠均灌胃相應(yīng)藥物（以生理鹽水為溶劑），假手術(shù)組和模型組大鼠均灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。

2.4 外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）水平的測定

于給藥后1、3、7 d采集大鼠內(nèi)眥靜脈叢血1 mL，以2 000 r/min離心20 min，采用Ficoll密度梯度離心法提取外周血中的單核細(xì)胞層，重懸于適量0.5%BSA中，混勻；依次加入FITC-CD31、PE-CD34抗體（分別為10、2 μL），同時(shí)以PE-IgG、FITC-IgG二抗（各10 μL）為陰性對(duì)照，振蕩混勻后，于室溫下避光孵育10 min，加入0.5%BSA 2 mL，混勻；以1 500 r/min離心10 min，用0.5%BSA清洗，棄去上清液，將沉淀重懸于適量0.5%BSA中，用流式細(xì)胞儀測定各組大鼠外周血中EPCs水平（每20萬個(gè)外周血單核細(xì)胞中檢出FITC-CD31和PE-CD34雙標(biāo)記的即被認(rèn)為是EPCs）。

2.5 神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分

于給藥后7 d采用改良Garcia法[19]對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，包括自主運(yùn)動(dòng)（0～3分）、鼠籠攀援（1～3分）、前肢對(duì)稱性（0～3分）、活動(dòng)對(duì)稱性（0～3分）、觸摸觸須反應(yīng)（1～3分）、觸摸雙側(cè)軀干反應(yīng)（1～3分）等6項(xiàng)，總分為18分，分?jǐn)?shù)越低表明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

2.6 腦梗死體積百分比的測定

采用TTC染色法測定各組大鼠的腦梗死體積。經(jīng)神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分后斷頭處死各組大鼠，并將其大腦置于腦槽中，制備冠狀切片（2 mm），置于2%TTC染色劑中，于37℃下避光染色30 min。將染色后的腦組織置于4℃、4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，拍照，采用Image Pro Plus 7.0軟件處理并計(jì)算腦梗死體積[正常腦組織染色后呈紅色（非蒼白區(qū)），梗死腦組織因未著色而呈白色（蒼白區(qū)）；腦梗死面積為對(duì)側(cè)正常腦組織半球面積與患側(cè)正常腦組織面積的差值，總腦梗死體積為各腦切片梗死面積之和乘以切片厚度（2 mm），腦梗死體積百分比為總腦梗死體積與全腦體積的比值][20]。

2.7 腦組織病理學(xué)觀察

取大鼠腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（5 μm），經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色后，置于熒光倒置顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織的病理學(xué)變化。

2.8 腦組織梗死區(qū)域微血管密度（MVD）的測定

取大鼠腦組織（處死前已注射FITC-D）置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（5 μm），參照Weidner法[21]測定大鼠腦組織梗死區(qū)域的MVD。尋找梗死區(qū)域內(nèi)5個(gè)血管密集區(qū)，于200倍熒光倒置顯微鏡下計(jì)算該區(qū)域內(nèi)被染成綠色的微血管數(shù)目。每份切片均選取5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)，取其平均值。

2.9 腦組織梗死區(qū)域微血管新生相關(guān)因子的測定

于冰浴中切取大鼠腦組織梗死區(qū)域適量，去除腦膜和血液，加入4℃PBS適量，勻漿約1 min，制成10%腦組織勻漿。勻漿于4℃下、以3 000 r/min離心20 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）以全波長酶標(biāo)儀測定腦組織中VEGF、VEGFR2、NO水平，嚴(yán)格按照檢測試劑盒說明書操作。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)和Levene檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性分析，符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠外周血EPCs水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)外周血EPCs水平均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，訶子提取物中、高劑量組大鼠各時(shí)間點(diǎn)外周血EPCs水平均顯著提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），且該指標(biāo)于給藥后3 d達(dá)到峰值，給藥后7 d有所下降；而訶子提取物低劑量組大鼠各時(shí)間點(diǎn)外周血EPCs水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表1。

表1 各組大鼠外周血EPCs水平比較（x±s，n＝8）Tab 1 Comparison of EPCs levels in peripheral blood of rats among different groups（x±s，n＝8）

3.2 各組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，訶子提取物中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分均顯著提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；而訶子提取物低劑量組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分和腦梗死體積百分比比較（x±s，n＝8）Tab 2 Comparison of neurological function scores and the volume percentage of cerebral infarction of rats among different groups（x±s，n＝8）

3.3 各組大鼠腦梗死體積百分比比較

假手術(shù)組大鼠腦組織中未見梗死區(qū)域，而模型組則可見明顯的梗死區(qū)域，且其腦梗死體積百分比較假手術(shù)組顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，訶子提取物中、高劑量組大鼠腦梗死區(qū)域明顯縮小，且其腦梗死體積百分比均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而訶子提取物低劑量組大鼠腦梗死區(qū)域雖有所縮小，但其腦梗死體積百分比與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見圖1、表2。鑒于上述結(jié)果，本研究以訶子提取物中、高劑量組大鼠為對(duì)象進(jìn)行后續(xù)的機(jī)制研究。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色結(jié)果Fig 1 TTC staining results of cerebral tissue in rats of each group

3.4 各組大鼠腦組織病理學(xué)變化情況比較

假手術(shù)組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞及毛細(xì)血管形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整，未出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變；模型組大鼠腦組織梗死區(qū)域周圍細(xì)胞排列較紊亂，部分細(xì)胞核固縮、溶解，胞體縮小；與模型組比較，訶子提取物中、高劑量組大鼠腦組織梗死區(qū)域明顯縮小，壞死細(xì)胞明顯減少，詳見圖2。

3.5 各組大鼠腦組織梗死區(qū)域MVD比較

圖2 各組大鼠腦組織病理學(xué)顯微觀察結(jié)果（HE染色，×400）Fig 2 Pathological microscopic observation results of cerebral tissue in rats of each group（HE staining，×400）

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織梗死區(qū)域MVD顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，訶子提取物中、高劑量組大鼠腦組織梗死區(qū)域MVD均顯著提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表3。

表3 各組大鼠腦組織梗死區(qū)域MVD及VEGF、VEGFR2、NO水平比較（x±s，n＝8）Tab 3Comparison of MVD，VEGF，VEGFR2 and NO levels in cerebral infarction area of rats among different groups（x±s，n＝8）

3.6 各組大鼠腦組織梗死區(qū)域VEGF、VEGFR2、NO水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織梗死區(qū)域VEGF、VEGFR2、NO水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，訶子提取物中、高劑量組大鼠上述指標(biāo)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表3。

4 討論

血管新生對(duì)缺血區(qū)域腦組織微血管循環(huán)的改善、缺血組織的保護(hù)和神經(jīng)功能的恢復(fù)均具有重要意義[22]。治療性血管新生與傳統(tǒng)藏醫(yī)“補(bǔ)隆養(yǎng)血”、中醫(yī)“益氣生脈”理論均密切相關(guān)[23]。在藏醫(yī)理論中，缺血性腦病為“隆血兩虛”，屬“脈癱”，其治法強(qiáng)調(diào)“血”“隆”“脈”三者結(jié)合，通過“補(bǔ)隆養(yǎng)血”的方法達(dá)到治療腦卒中的目的[24]。訶子作為“藏藥之王”，有補(bǔ)隆養(yǎng)血、益氣生脈之功效，由其組成的藏藥方劑三果湯也廣泛應(yīng)用于心腦血管等疾病的治療[23]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，藏藥方劑三果湯[25-26]及訶子提取物[27]在腦缺血再灌注模型中可發(fā)揮腦血管保護(hù)作用，但這種保護(hù)作用與腦梗死區(qū)域血管新生的相關(guān)性及其分子作用機(jī)制鮮有報(bào)道，因此本研究對(duì)訶子提取物上述保護(hù)作用的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。由于本課題組前期已初步證實(shí)了訶子提取物及其藥效成分的腦保護(hù)作用[9-11]，本研究主要針對(duì)其促血管新生作用及可能機(jī)制進(jìn)行探索，故未增設(shè)陽性對(duì)照藥物組。

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠外周血EPCs水平顯著下降，神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分顯著下降，且腦組織中可見明顯的梗死區(qū)域，腦梗死體積百分比顯著提高，提示大鼠發(fā)生了腦缺血再灌注損傷，MCAO模型復(fù)制成功。與模型組比較，訶子提取物中、高劑量組大鼠外周血EPCs水平均顯著升高，且于給藥后3 d達(dá)到峰值，同時(shí)其神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分顯著提高，腦梗死體積百分比顯著降低，提示訶子提取物對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，并可在用藥早期促進(jìn)EPCs的大量分化、增殖。隨后本研究又以中、高劑量的訶子提取物為對(duì)象，考察了其對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的可能機(jī)制。

MVD是反映血管新生能力的有效指標(biāo)，其值與新生毛細(xì)血管豐富度成正比[22]。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量的訶子提取物可顯著提高大鼠腦組織梗死區(qū)域的MVD，提示其可改善該區(qū)域血流量，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能的恢復(fù)。VEGF在新生血管的生長過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，研究表明腦缺血再灌注損傷后，VEGF活化可誘導(dǎo)VEGFR表達(dá)上調(diào)，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)新血管生成，并能在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)抗凋亡蛋白表達(dá)，從而維持內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)、保持血管功能的完整性[28-29]。VEGFR2主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，是VEGF的特異性膜受體，是一種具有高親和力的酪氨酸激酶受體[30]。來自內(nèi)皮的NO是眾多血管生長因子的下游介質(zhì)，具有增加分泌促血管生成介質(zhì)并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移的作用，是誘導(dǎo)新血管生成所必需的物質(zhì)[31]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠VEGF、VEGFR2、NO水平均顯著升高，提示MCAO模型建立后腦組織相關(guān)因子的表達(dá)會(huì)呈應(yīng)激性升高；與模型組比較，訶子提取物中、高劑量組大鼠上述指標(biāo)均進(jìn)一步顯著升高，表明訶子提取物可通過上調(diào)腦組織梗死區(qū)域的VEGF、VEGFR2、NO的表達(dá)來促進(jìn)其微血管新生和神經(jīng)功能恢復(fù)。這提示訶子提取物促血管新生的作用可能與上調(diào)VEGF、VEGFR2、NO的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了訶子提取物可提高腦缺血再灌注損傷模型大鼠外周血EPCs水平、神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分和梗死區(qū)域MVD，減小其腦梗死體積，對(duì)其缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用；其機(jī)制可能與上調(diào)血管新生相關(guān)因子（VEGF、VEGFR2、NO）的表達(dá)有關(guān)。本研究為藏藥訶子防治腦缺血性疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。后續(xù)本課題組將進(jìn)一步探討其具體藥效成分，深入挖掘其作用機(jī)制，并開展藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)研究。