姜曉東，李新鳳，郝艷平，趙 靚，呂晉慧，賈舉慶，張春來*

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藜麥β-香樹酯醇合酶和鯊烯合酶基因的克隆與表達①

姜曉東1，李新鳳1，郝艷平2，趙 靚2，呂晉慧2，賈舉慶1，張春來1*

(1 山西農業(yè)大學農學院，國家功能雜糧技術創(chuàng)新中心，山西省旱作栽培與作物生態(tài)重點實驗室，山西省黃土高原特色作物高效生產協同創(chuàng)新中心，山西太谷 030801；2 山西農業(yè)大學林學院，山西太谷 030801)

為了探明藜麥皂苷生物合成的分子機制，試驗以藜麥品種隴藜1號為材料，利用已有的轉錄數據，通過RT-PCR技術鑒定參與三萜皂苷生物合成關鍵酶基因，采用生物信息學分析方法進行了基因編碼蛋白保守結構域、蛋白二級結構及系統發(fā)育樹的構建，并利用半定量RT-PCR 方法進行了目的基因在籽粒不同發(fā)育時期和植株不同部位(根、莖、葉和籽粒)表達水平的研究。試驗克隆得到三萜烯皂苷生物合成途徑中關鍵酶編碼基因、和的cDNA 全長序列。半定量RT-PCR 表達分析表明，和在葉片、籽粒中表達量最高，各基因在籽粒不同發(fā)育時期的表達量間無顯著差異。本研究對藜麥三萜皂苷生物合成途徑中關鍵酶基因表達模式的研究，將為進一步探明藜麥皂苷生物合成的分子機制及發(fā)掘影響藜麥皂苷含量的關鍵基因奠定基礎。

藜麥；籽粒發(fā)育；關鍵酶基因；克隆；半定量RT-PCR

皂苷是由植物通過特定的代謝途徑產生的具有生物活性、結構多樣的次生代謝產物。其在制藥、食品和化妝品等行業(yè)具有廣泛應用。目前已基本明確了植物中三萜類皂苷物質生物合成途徑的基本步驟。植物中皂苷物質主要是通過甲羥戊酸途徑中產生的前體物質，用于三萜類皂苷化合物的生物合成。在這一過程中由兩個異戊二烯焦磷酸(IPP)與一個烯丙基異構體——二甲基丙基焦磷酸(DMAPP)縮合生成焦磷酸烯丙基焦磷酸(FPP)，之后兩個FPP單元縮合生成三萜前體物質——角鯊烯。角鯊烯通過2,3-氧化鯊烯環(huán)化酶(OSC)的環(huán)氧化作用生成2,3-氧化鯊烯，這一環(huán)化產物成為植物中合成特定的三萜類化合物共同的前體物質。該前體物質通過特定合成酶的催化作用，產生不同的三萜化合物，如通過β-香樹素合成酶對2,3氧鯊烯的環(huán)化作用，產生的β-香樹酯醇是齊墩果烷型三萜皂苷的特定前體物質。之后，三萜前體通過一個或多個細胞色素P450依賴單加氧酶的氧化作用，形成具有三萜化合物結構的皂苷元，皂苷元經糖基轉移酶的糖基化作用合成皂苷[1-5]。因此，三萜類皂苷物質的生物合成途徑作為復雜的生物過程，生物合成途徑的每一階段均受到相應酶類的催化或修飾作用。

隨著對甲羥戊酸途徑中次生代謝產物生物合成途徑研究的日趨深入，現已在多種植物中對代謝途徑中關鍵酶基因進行了成功的克隆及分析。研究表明基因表達水平的變化，直接影響到次生代謝產物的生物合成，如Chen等[6]和Banyai等[7]通過對倍半萜內酯類化合物生物合成途徑中基因作用機制的研究表明，法尼基焦磷酸合酶基因()的過表達，導致代謝產物青蒿素含量的顯著增加。同樣，植物三萜類皂苷生物合成分子調節(jié)機制研究的結果表明，皂苷生物合成途徑中的相關酶基因的表達對三萜皂苷類物質的生物合成起著重要的調節(jié)作用[8-10]。藜麥中皂苷含量是其品質性狀評價的重要指標，然而，鮮見有關藜麥皂苷生物合成途徑中作用機制方面的研究報道。據此，本研究通過對藜麥三萜類皂苷生物合成途徑中鯊烯合酶(squalene synthase，SS)、β-香樹酯醇合成酶(β-amyrin synthase，bAS) 基因的克隆、組織特異性表達分析，旨在為探明藜麥中皂苷類物質生物合成的調節(jié)機制奠定一定的分子基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗以隴藜1號為試驗材料，于2016 年6—10月分別選取花后15、20、25、30 d 5個時期的藜麥籽粒、葉片、根和莖組織，液氮處理后置于–80℃冰箱保藏備用。

1.2 RNA提取及cDNA一鏈合成(1.3 RNA 的提取和cDNA 的合成)

利用RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)進行組織樣品的總RNA提取，通過1% 瓊脂糖凝膠電泳，并使用Nanodrop 分光光度計進行RNA質量和濃度檢測。取1 μg總RNA為模板利用反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)，反轉錄合成一鏈cDNA。

1.3 cDNA 全長的獲得

試驗根據已有的轉錄組數據，以反轉錄cDNA一鏈為模板，進行藜麥鯊烯合酶基因(、)和藜麥β-香樹酯醇合成酶基因()全長cDNA序列擴增。引物設計采用DNAMAN軟件(version 6.0，Lynnon 公司)設計基因特異性引物，引物序列見表1。

反應體系為25 μl，包括1 μl 2.5 U/μl TransTaq? HiFi DNA Polymerase (TransGen Biotech)，2.5 μl 10× TransTaq? HiFi BufferII，1.0 μl 2.5 mmol/L dNTPs，正向引物1 μl 10 mmol/L，反向引物1 μl 10 mmol/L，1.0 μl cDNA 模板和17.5 μl ddH2O。PCR 程序為：94℃預變性 5 min；35 個循環(huán)(94℃變性30 s；62℃()、53℃()、57℃()退火30 s；72℃延伸 1 min)；72℃延伸10 min。PCR 擴增產物經膠回收純化后，與pEASY-T1 克隆載體 (TransGen Biotech) 連接，連接產物轉化到大腸桿菌DH5α中，隨機挑選陽性克隆，經菌液PCR 驗證后，送生工生物工程(上海) 有限公司測序。

1.4 半定量RT-PCR(Semi RT-PCR )分析

試驗以隴藜1 號的根、莖、葉及花后15、20、25、30 d籽粒的cDNA為模板，以作為內參基因，利用半定量RT-PCR 對皂苷生物合成途徑相關基因和的表達量進行分析，同時檢測這3個基因在葉片、幼莖、根和籽粒中的表達水平。

采用Primer3軟件(version4.0)進行基因的半定量表達引物設計，引物序列見(表1)。PCR 反應體系25 μl，其中引物各10 mmol，dNTP 各2 mmol，10×PCR 反應緩沖液2.5 μl，Taq 酶0.25 μl (5 U/μl)，模版cDNA為50 ng。反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，目的基因為28 個循環(huán)，為30 個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產物經2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測基因的表達量。

表1 基因克隆和半定量PCR引物設計

1.5 生物信息分析

利用DNAMAN軟件進行基因開放閱讀框(ORF)氨基酸序列推導；利用TRMHMM server v2.0 (http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)在線軟件進行蛋白跨膜結構域預測；采用在線軟件Prot-Param (http://www.expasy.org)進行蛋白的分子量、理論等電點及保守結構域的預測；使用ExPASy 網站提供的在線分析軟件SOPMA 預測蛋白質二級結構，利用Phyre2在線軟件進行蛋白三級結構預測；采用Clustal W 軟件進行氨基酸多序列比對；利用MEGA6.0 軟件中的最大似然法(maximum likelihood，ML)構建系統發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 CqSS1和CqSS2基因克隆及序列分析

以花后25 d籽粒反轉錄cDNA為模板，擴增得到序列長度均為 1 242 bp 的兩個鯊烯合酶基因，定名為和，其編碼413個氨基酸。進一步對和基因編碼蛋白的一級結構預測分析發(fā)現，CqSS1和CqSS2蛋白的分子量分別為 47.8、47.4 kDa，等電點分別為6.32、6.50。利用基于隱碼模型的TMHMM 工具進行跨膜區(qū)分析表明，CqSS1 蛋白C端和C端鄰近區(qū)有2個跨膜區(qū)，而CqSS2蛋白只有1個位于C端的跨膜區(qū)(圖1)。

SOPMA 預測的CqSS 蛋白二級結構結果表明，CqSS1 和CqSS2編碼的413個氨基酸殘基中，主要為螺旋，分別占70.70% 和70.94%，β轉角分別占3.87% 和3.63%，無規(guī)則卷曲分別占 21.79% 和21.07%，延伸鏈分別占3.63% 和4.36%，-螺旋和無規(guī)卷曲為該蛋白二級結構主要元件(圖2A)，這與Phyre2軟件三級結構預測結果相符(圖2B)。

(A: CqSS1的跨膜預測；B: CqSS2的跨膜預測)

(A：CqSS1蛋白的二級結構，藍色區(qū)域為α-螺旋，橙色區(qū)域為不規(guī)則卷曲，紅色區(qū)域為延展延伸鏈；B：CqSS1蛋白的三級結構，蛋白紅色部分為N端 α-螺旋，藍色部分為C端α-螺旋)

利用MEGA6.0 軟件中的最大似然法構建系統發(fā)育樹(圖3)。結果表明，藜麥中兩個CqSS蛋白聚在同一分枝，但與玉米()、松屬(a)、擬南芥()、青蒿素()、楊屬()等物種進化關系較近，而與龍葵屬()和茄屬()親緣關系相對較遠。

2.2 CqbAS基因的全長cDNA克隆及序列分析

的cDNA全長 2 292 bp，編碼763個氨基酸，蛋白的一級結構預測分析結果表明，蛋白預測理論分子量為87.9 kDa，等電點為5.73；SOPMA 預測的CqbAS 蛋白二級結構結果表明，CqbAS 蛋白主要由螺旋(44.17%)、無規(guī)則卷曲(35.39%)、延伸鏈(13.24%)和β-轉角(7.21%)組成，可推測-螺旋和無規(guī)卷曲為CqbAS 蛋白二級結構主要的組成元件，該結果與蛋白三級結構預測結果相符(圖4)。

圖3 藜麥CqSS 蛋白與植物中鯊烯合酶家族成員的進化關系分析

系統發(fā)育樹(圖5)分析結果表明，CqbAS蛋白與同為石竹科的藥用植物麥藍菜()親緣關系最近，聚在同一分支，同時與其他植物如豌豆()、甘草()及大豆()的親緣關系較近，被分在同一亞族，與灌木型植物紫菀屬(Linn.)、杜莖山()屬親緣關系最遠。

2.3 CqSS和CqbAS基因表達分析

2.3.1和基因組織特異性表達 試驗結果表明(圖6)，基因在藜麥各組織中均有表達，但基因在不同組織中表達量存在明顯差異，該基因在藜麥籽粒和葉片中的表達量相對較高，而在根和莖組織中的表達水平極低；基因在各組織中均有表達，但表達水平相對較低；與基因的表達趨勢一致，在籽粒和葉片中高表達，而在根和莖組織呈現較低表達水平。

(A：CqSS1蛋白的二級結構，藍色區(qū)域為α-螺旋，橙色區(qū)域為不規(guī)則卷曲，紅色區(qū)域為延展延伸鏈；B：CqSS1蛋白的三級結構，蛋白紅色部分為N端α-螺旋，藍色部分為C端α-螺旋)

圖5 藜麥CqbAS蛋白與植物β-香樹酯醇合成酶家族成員的進化關系分析

圖6 CqSS和CqbAS的組織特異性表達

2.3.2和在籽粒發(fā)育過程中的表達 通過對花后15、20、25、30 d藜麥籽粒發(fā)育過程中和基因表達模式測定分析，結果表明兩基因在花后不同時期的基因表達量無顯著差異(圖7)。

圖7 藜麥籽粒發(fā)育時期種子中CqSS1和CqbAS表達水平的半定量RT-PCR

3 討論

依賴于甲羥戊酸途徑的三萜皂苷的生物合成途徑，鯊烯合酶(SS)和β-香樹酯醇合成酶(bAS)是催化齊墩果烷型三萜皂苷生物合成過程的兩個關鍵酶。本研究對鯊烯合酶基因克隆，分別得到兩個鯊烯合酶編碼基因、，利用TMHMM 跨膜工具進行分析，結果顯示CqSS1含有兩個跨膜區(qū)，而CqSS2只有一個位于C-端的跨膜結構域。研究表明，擬南芥、煙草、酵母和人類的鯊烯合酶中只在蛋白C末端的疏水區(qū)域含有一個跨膜區(qū)[11-12]。而對于富含皂苷的物種，鯊烯合酶蛋白除在C末端含有一個跨膜區(qū)外，在靠近C-末端的鄰近區(qū)域還含有額外的跨膜螺旋，如大豆、三七、西洋參以及甘草等富含皂苷物種，鯊烯合酶蛋白C端均含有兩個跨膜螺旋[13-15]。研究認為額外的跨膜螺旋可能有利于促進鯊烯合酶在內質網膜(ER)的定位[16-18]。鯊烯合酶是甲羥戊酸途徑中的第一個關鍵限制因子，鯊烯合酶在植物甾醇和三萜類皂苷物質合成具有重要的調節(jié)作用。本研究通過CqSS1蛋白氨基酸序列與其他物種參與皂苷生物合成的鯊烯合酶的序列比對結果表明，CqSS1含有植物中鯊烯合酶的特性序列，且根據基因的表達特性分析結果，進一步表明CqSS1參與藜麥三萜類皂苷的生物合成。甲羥戊酸合成途徑中鯊烯合酶負責將法尼?；姿峥s合生成由30個碳原子組成的三萜前體物質——角鯊烯，完成三萜類化合物生物合成途徑中的前體物質的生物合成[10]。

在籽粒發(fā)育時期的表達特性表明，基因在籽粒發(fā)育各時期的表達水平間無顯著差異，該結果表明，香葉基二磷酸合酶、法尼基二磷酸合酶、鯊烯合酶及鯊烯單加氧酶作為三萜皂苷生物合成途徑中上游調控的關鍵酶，其在代謝途徑中合成的各種次生代謝產物是植物維持生命活動所必需的，這些酶類編碼基因的表達水平的穩(wěn)定性表達，對植物維持正常的生命活動起著重要的調節(jié)作用。因此，基于基因表達特性的測定結果，推測藜麥中的皂苷物質生物合成途徑下游關鍵酶的編碼基因可能在皂苷的生物合成中起著重要的調節(jié)作用。

據此，本試驗進一步對皂苷生物合成途徑中的β-香樹酯醇合成酶(bAS)基因的表達模式進行研究。β-香樹酯醇合成酶作為三萜類皂苷生物合成的第一個限速酶[19-22]，該酶在皂苷生物合成途徑中負責催化三萜苷元骨架——β-香樹酯醇的生物合成，因此，對皂苷物質的生物合成具有重要的調節(jié)作用。本研究對藜麥中β-香樹酯醇合成酶基因的克隆和基因的組織特異性表達分析，結果顯示該基因編碼編碼763個氨基酸。CqbAS蛋白序列分析和進化分析表明，CqbAS與其他植物中三萜皂苷的生物合成途徑相關的β-香樹酯醇合成酶蛋白的氨基酸序列具有高度的同源性。基因的組織特異性表達結果顯示，該基因在籽粒和葉片中高表達，推測藜麥中皂苷物質的合成主要在籽粒和葉片中累積[23-26]，但在籽粒發(fā)育過程中，基因的表達無顯著性差異，可以推測影響藜麥皂苷生物合成的基因可能發(fā)生在三萜苷元骨架的生物合成過程之后。

三萜類皂苷化合物是來源于植物的一類重要的次生代謝產物，藜麥中的皂苷含量與藜麥加工品質關系密切。而作物品質性狀不但取決于遺傳因素，即品種基因型的影響，同時栽培方式同樣對作物品質性狀產生較大影響。眾多研究表明，種植方式對作物的生長、病蟲的發(fā)生情況，特別是對作物品質性狀有重要的影響，邱立友等[27]對連作產生的障礙機理研究表明，包括萜類生物堿和苯丙烷類的次生代謝物所產生的新生植物自毒作用，是導致連作障礙發(fā)生的關鍵因素之一。因此，改變種植方式能夠在較大程度上克服由于連作導致的障礙[28]。徐雪鳳等[29]通過油葵與馬鈴薯的輪作研究，發(fā)現輪作可以通過提高土壤有機質、有效磷和堿解氮含量，而提高土壤酶活性、細菌數量，致使土壤環(huán)境得到明顯改善，從而減輕病害的發(fā)生和自毒作用。這些研究結果為指導藜麥生產，以豆科作物作為輪作作物應用到藜麥種植中，不但克服了由于連作而產生的種植障礙，而且減輕了當今藜麥生產中病蟲害發(fā)生嚴重的問題，在提高藜麥品質及產量方面將起到了重要作用。

本研究通過藜麥鯊烯合酶基因、β-香樹酯醇合成酶基因的克隆和組織特異性表達分析，為進一步通過篩選三萜皂苷生物合成途徑中下游酶編碼的候選基因研究，及發(fā)掘影響藜麥皂苷生物合成的關鍵基因奠定了基礎。

4 結論

本研究克隆得到藜麥皂苷生物合成途徑中的兩個編碼鯊烯合酶基因(和)和β-香樹酯醇合成酶基因()，和的cDNA長度為1 242 bp，編碼413個氨基酸，CqSS1的 C端含有2個跨膜結構域，且CqSS1 具有植物鯊烯合酶的特征序列，而CqSS2的 C端含有1個跨膜結構域。的cDNA長度為2 292 bp，編碼763個氨基酸。和基因在籽粒和葉片中高表達，而基因的表達量極低，基因和在種子不同發(fā)育時期的表達無顯著差異，推測和基因參與了藜麥皂苷物質的生物合成，且推測三萜類皂苷生物合成途徑中的下游基因對皂苷的生物合成具有重要的調節(jié)作用。

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Gene Cloning and Express of Squalene Synthase and β-amyrin Synthase from

JIANG Xiaodong1, LI Xinfeng1, HAO Yanping2, ZHAO Jing2, LV Jinhui2, JIA Juqing1, ZHANG Chunlai1*

(1 College of Agronomy, Shanxi Agricultural University; National Innovation Centre for Functional Speciality Crops; Shanxi Key Laboratory for Arid Agriculture and Crop Ecology; Shanxi Collaboration and Innovation Centre for Efficient Production of Speciality Crops in Loess Plateau, Taigu, Shanxi 030801, China; 2 College of Forestry, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi 030801, China)

To explore the molecular mechanism of saponin biosynthesis from, varietycv. Longli 1 was used as materials, and experiment was carried out by using RT-PCR technology to identify the key enzyme which involved in triterpenes saponin biosynthesis. Then the conserved domain, secondary structure of protein and phylogenetic tree were analyzed by using bioinformatics methods, and organ-specific expression patterns of genes in seed, root stem and leaf were detected by semi-quantitative RT-PCR. The expression pattern of target gene were also investigated during seed developing period. Full-length cDNAs of,andwere cloned, and gene expression results showed that bothandwere highly expressed in leaf and seed than in other tissues, and express pattern remained in same level in different seed developing stage. This study is the first comprehensive analysis of the expression patterns of pivotal genes for triterpene saponin biosynthesis in, and provides a basis to further elucidate the molecular mechanism for the biosynthesis of saponin.

; Grain develepoment; Key enzyme gene; Cloning; Semi-quantitative RT-PCR

山西農谷建設科研專項項目(SXNGJSKYZX201704)和山西省重點研發(fā)計劃項目(201703D221006-3)資助。

(3108827452@qq.com)

姜曉東(1965—)，男，山東曹縣人，博士，副教授，研究方向為雜糧分子育種。E-mail：caas08f2e1a@aliyun.com

10.13758/j.cnki.tr.2018.06.025

S-9

A