李衛(wèi)，孟慶剛，楊琪，曲志偉，畢佳琦，成勇，林琛，李寶林，劉銳

（哈爾濱市第一醫(yī)院 手外科，黑龍江 哈爾濱 150001）

手部外傷后瘢痕組織嚴(yán)重影響患肢的功能，治療效果往往不佳，而聲動(dòng)力療法一直是近年來(lái)研究熱點(diǎn)[1]。我們前期研究結(jié)果已表明，DVDMS-SDT效應(yīng)對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞有毒殺作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)各種實(shí)驗(yàn)方法為DVDMS-SDT效應(yīng)抗人瘢痕研究提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)與生長(zhǎng)

取人增生性瘢痕組織(離體后4 h內(nèi))，將所得標(biāo)本用生理鹽水漂洗數(shù)次，去除上皮部分，切成2 mm×2 mm大小的組織塊，送入無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，按一定間距平鋪，向瓶中加入少量培養(yǎng)液。將組織塊鋪于瓶底培養(yǎng)，細(xì)胞經(jīng)3～4次傳代培養(yǎng)后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(取第5代之內(nèi)的細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)研究)，待細(xì)胞70%～80%融合時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞、200μL培養(yǎng)液分別均勻接種于96孔培養(yǎng)板中[2]。每種實(shí)驗(yàn)條件均設(shè)3復(fù)孔。所有人員簽署知情同意書并經(jīng)哈爾濱市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及DVDMS-SDT作用

分為對(duì)照組（C組）、單純超聲組（U組）、單純?nèi)A卟啉鈉藥物組（DVDMS組）、華卟啉鈉聲動(dòng)力組（DVDMS-SDT）。超聲輻照儀：天使牌，美國(guó)斯坦福大學(xué)超聲波實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合北京（中美）天使科技有限公司產(chǎn)品。治療參數(shù)：超聲頻率1.0 MHz(兆赫)，超聲聲強(qiáng)0.8 W/cm2，超聲輻照時(shí)間120 s，每日1次。向培養(yǎng)皿中注射DVDMS（2μg/mL），華卟啉鈉由青龍高科技股份有限公司研制，規(guī)格10 mg/瓶，l，3 h后進(jìn)行超聲輻照，超聲探頭在水中與瘢痕相距1.0 cm[2]。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

實(shí)驗(yàn)分組如下（每組3 mL細(xì)胞懸液）：C組、U組、DVDMS組、DVDMS-SDT組。超聲輻射條件同上，超聲輻射后，用臺(tái)酚藍(lán)立刻進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整幸存的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞密度至1×105個(gè)細(xì)胞/mL，分別接種于96孔板，200μL/孔，每組種5復(fù)孔，置于37℃，5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。分別于12，24，36，48h各取一塊96孔板加MTT20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸掉上清液，加入DMSO每孔200μL振蕩10 min，用自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)在490 nm波長(zhǎng)下各孔OD值。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將預(yù)處理的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，根據(jù)試劑盒依次加入MTT20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，加入溶解液，振蕩搖勻，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定，計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體跨膜電位

實(shí)驗(yàn)分為四組（每組3 mL細(xì)胞懸液），DVDMS濃度：2μg/mL（于超聲輻照前4 h加入），超聲輻照前3.5 h加入羅丹明123（10μg/mL）0.5 mL。超聲輻照條件：0.80 W/cm2×120 s。超聲輻照后，將四組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入50 mL培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。3 h后收集細(xì)胞，參照文獻(xiàn)方法，PBS洗2次去血清，37℃避光孵育30 min，PBS漂洗2次，加入0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，常規(guī)處理后，DVDMS濃度：2μg/mL（于超聲輻照前4 h加入），超聲輻照前3.5 h，加入DCFH-DA 10μmoL/L的，加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，方法同上檢測(cè)。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，常規(guī)處理后，超聲輻照前3.5 h加 Fluo-3-Am 5μL（10μmol/L），置二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，其間輕微振蕩3次，方法同上，檢測(cè)超聲輻照條件同上。超聲輻照后，輻照3 h后收集細(xì)胞，離心去掉多余染料，再用無(wú)鈣緩沖液反復(fù)洗滌3次，最后用無(wú)鈣緩沖液稀釋至1 mL，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm。

1.7 螢光顯微鏡觀察（Hoechst33258染色法）

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，常規(guī)處理后，以每孔1 mL接種在24孔板內(nèi)。24 h后取有細(xì)胞生長(zhǎng)良好且均勻的血蓋片，超聲輻照條件同上。超聲輻照后，將細(xì)胞爬片置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。6 h后取出細(xì)胞爬片，用PBS洗2次去血清，加入1 mL的4%甲醛溶液，4℃固定細(xì)胞10 min，用PBS洗2次，滴加 Hoechst 33258染液100μL，室溫染色10 min，蒸餾水沖凈晾干，以紫外光波長(zhǎng)激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 DVDMS-SDT作用對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響

DVDMS-SDT作用對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響結(jié)果見表1，從表1可見，DVDMS-SDT組光密度值明顯較同一時(shí)間點(diǎn)C組、DVDMS組、U組低（P＜0.01）。而DVDMS對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用。

2.2 DVDMS-SDT作用對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞線粒體跨膜電位的影響

本實(shí)驗(yàn)用羅丹明123作為熒光探針測(cè)定人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)的線粒體跨膜電位。從流式細(xì)胞儀分析結(jié)果圖中可清楚地看到兩個(gè)峰值，表明人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)線粒體跨膜電位的減少只發(fā)生在部分細(xì)胞中，因而該結(jié)果以百分比表示較為科學(xué)。三組細(xì)胞線粒體跨膜電位降低的百分比分別為：C 組(7.76±1.63)%，DVDMS 組（10.74±0.72）%，U組(20.45±4.76)%，DVDMS-SDT 組(54.36±9.13)%，可見DVDMS-SDT組線粒體跨膜電位均明顯下降，與C組、DVDMS組、U組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 DVDMS-SDT作用對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響

2.3 DVDMS-SDT作用對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響

本實(shí)驗(yàn)用DCFH-DA染料孵育后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，DCF的熒光強(qiáng)度增高的細(xì)胞百分比分別為：C組(1.87±0.67)%、DVDMS 組 （7.01±1.73%），U 組(28.73±2.87)%、DVDMS-SDT 組(70.93±2.76%)，可見后兩組活性氧水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），尤其以DVDMS-SDT最為顯著，與C組、DVDMS組、U組比較，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 DVDMS-SDT作用對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的影響

本實(shí)驗(yàn)用 Fluo-3-Am染料孵育后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)luo-3與鈣離子集合后熒光強(qiáng)度增高的細(xì)胞百分比分別為：C組(1.32±0.35)%、DVDMS組（2.76±1.39%）、U 組 (32.67 ±1.09%)、DVDMS-SDT 組(60.67±4.32%)，可見后兩組鈣離子水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），尤其以DVDMS-SDT組最為顯著，與C組、DVDMS組、U組比較，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖 1-4）。

2.5 螢光顯微鏡觀察人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞核的變化

細(xì)胞核的變化是細(xì)胞壞死和凋亡的主要標(biāo)志，C組：人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞核清晰可見，染色均勻，邊界清楚，大小不一，形狀不一。DVDMS組：人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與對(duì)照組比較無(wú)明顯改變，細(xì)胞核染色均勻，輪廓清楚，偶見細(xì)胞輕微腫脹。SDT組和U組都有細(xì)胞損傷，SDT組細(xì)胞的損傷程度明顯大于單純超聲作用，部分細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮，染色加深,核體積縮小，即核濃縮。U組：其細(xì)胞損傷的數(shù)量和程度明顯低于DVDMS組，部分人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞出現(xiàn)核濃縮。

圖1 -4 DVDMS-SDT效應(yīng)對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響

3 討論

增生性瘢痕是皮膚損傷后組織異常修復(fù)的一種病理現(xiàn)象，其高發(fā)生率嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，目前尚缺乏有效的治療方法。我們前期研究發(fā)現(xiàn)DVDMS-SDT療法用于治療兔增生性瘢痕具有顯著的療效，能夠顯著引起增生性瘢痕中成纖維細(xì)胞的凋亡。人增生性瘢痕目前現(xiàn)有的手段治療效果均不理想，因而一直是臨床研究的熱點(diǎn)[4]，因此我應(yīng)用DVDMS作為聲敏劑，探討從細(xì)胞增殖狀況觀察DVDMS-SDT效應(yīng)對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的遲發(fā)抑制作用，并初步探討其作用機(jī)制，為增生性瘢痕治療提供新的手段。

本實(shí)驗(yàn)MTT檢測(cè)結(jié)果證實(shí)單純超聲作用后人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖代謝活性下降，而在DVDMS存在時(shí)，人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖代謝活性下降更明顯，但DVDMS對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯影響。提示本實(shí)驗(yàn)條件下SDT作用降低了人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖代謝活性。由于 MTT法檢測(cè)反映的是活細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶的活性，故本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明SDT作用后人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶的代謝活性降低。在DVDMS-SDT治療過(guò)程中，聲敏劑經(jīng)超聲輻照后產(chǎn)生的 ROS是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的一大原因，眾多研究表明細(xì)胞內(nèi) ROS所致的氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]?；钚匝酰≧eactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生是聲動(dòng)力治療（SDT）殺傷細(xì)胞的主要機(jī)制。超聲通過(guò)作用于細(xì)胞內(nèi)的水相環(huán)境引起聲空化效應(yīng)，通過(guò)激活增敏劑產(chǎn)生大量的ROS，從而直接介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用。在細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧分子ROS，如超氧陰離子等自由基。當(dāng)細(xì)胞在內(nèi)外環(huán)境的刺激后，ROS產(chǎn)生增多，從而破壞了機(jī)體氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用DCFH-DA染料檢測(cè)了SDT作用后人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化。本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，在單純超聲輻照后人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS水平有所增加，而在DVDMS-SDT作用后 ROS增加更明顯，提示在該過(guò)程中有 ROS的參與。細(xì)胞內(nèi)的ROS成分是誘導(dǎo)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞壞死與凋亡的主要因素[6]。在SDT作用過(guò)程中，DVDMS受超聲輻照后可能首先產(chǎn)生氧自由基，而后這些基團(tuán)與細(xì)胞的某些物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生新的ROS繼續(xù)損傷細(xì)胞。在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證明，阻止線粒體通透性的改變可以防止細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用羅丹明123來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體跨膜電位的變化，提示SDT作用對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的線粒體損傷較重，說(shuō)明在SDT誘導(dǎo)后人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，線粒體發(fā)揮了重要作用。因此，可以認(rèn)為在本實(shí)驗(yàn)條件下，SDT作用后線粒體內(nèi)ROS的蓄積所造成的線粒體氧化應(yīng)激導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放，線粒體膜通透性增加及跨膜電位下降可能是SDT作用誘導(dǎo)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡和死亡的重要機(jī)制。鈣穩(wěn)態(tài)失衡也是細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一[6]，本實(shí)驗(yàn)顯示DVDMS-SDT同樣增高了人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)鈣離子，與C組、DVDMS組、U組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

綜上所述，SDT對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞有遲發(fā)抑制作用，我們認(rèn)為，超聲一方面通過(guò)超聲的機(jī)械作用可能直接破壞細(xì)胞，特別是膜結(jié)構(gòu)，另一方面通過(guò)空化效應(yīng)激活 DVDMS后產(chǎn)生一系列的自由基，鈣離子濃度增高，線粒體膜電位的改變而且相互作用，從而抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。