劉惠芬 衣葵花 劉文光 董亞茹 張志芳 李云芝 王安皆

摘要：斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ型（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus Ⅱ，SpltNPVⅡ）基因組DNA同源重復(fù)區(qū)hr1大小為1 746 bp，含有6個(gè)64 bp不完全回文序列、4個(gè)正向重復(fù)序列以及7個(gè)與病毒基因組DNA復(fù)制相關(guān)的基序。瞬時(shí)表達(dá)分析結(jié)果表明，SpltNPVⅡhr1在感染野生型家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）和苜蓿丫紋夜蛾多粒包埋型核多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）的BmN和Sf21細(xì)胞中均具有增強(qiáng)早期基因ie1啟動(dòng)子活性的功能，增強(qiáng)效率分別為30、350倍;實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，hr1在BmN和Sf21細(xì)胞中具有基因組DNA復(fù)制起始原點(diǎn)的功能，拷貝數(shù)分別為（8.46×104±6.13×103）、（592×106±2.95×105）copies/μg DNA。研究證明，SpltNPVⅡ hr1在異源細(xì)胞BmN和Sf21中具有復(fù)制起始原點(diǎn)和增強(qiáng)子的雙功能作用。

關(guān)鍵詞：斜紋夜蛾;核型多角體病毒;同源重復(fù)區(qū);hr1

中圖分類號(hào)： S433.4;Q78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）21-0100-03

收稿日期：2019-08-09

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金（編號(hào)：ZR2017BC080）;山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蠶桑產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：SDAIT-18-03）。

作者簡介：劉惠芬（1982—），女，山東滕州人，博士，助理研究員，主要從事昆蟲病毒學(xué)研究。Tel：（0535）6527628;E-mail：liuhuifen77@163.com。

通信作者：李云芝，研究員，主要從事家蠶病理研究，Tel：（0535）6527628，E-mail：yzli888@163.com;王安皆，副研究員，主要從事家蠶病理研究，Tel：（0535）6527628，E-mail：wangaj77@126.com。

桿狀病毒是一類環(huán)狀雙鏈DNA病毒，其基因組大小為80～180 kb。在桿狀病毒的發(fā)育循環(huán)中，DNA復(fù)制是其生命周期中最重要的一環(huán)，也是病毒增殖周期最重要的事件[1]。DNA復(fù)制原點(diǎn)是最為重要的順式作用元件，對(duì)DNA的復(fù)制極為重要。研究發(fā)現(xiàn)，桿狀病毒DNA復(fù)制原點(diǎn)有2種類型，分別為同源重復(fù)區(qū)（homologous repeat regions，hr）和非同源重復(fù)區(qū)起始位點(diǎn)（non-hr）[2-4]。其中，hr存在于大多數(shù)桿狀病毒基因組中，是目前研究較多的類型。

hr作為核型多角體病毒（nucleopolyhedrovirus，NPV）DNA復(fù)制原點(diǎn)已在眾多桿狀病毒中得到證實(shí)[5-9]。苜蓿丫紋夜蛾多粒包埋型核多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）基因組含有8個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，包括7個(gè)hr和1個(gè)HindⅢ-K片段，研究發(fā)現(xiàn)7個(gè)AcMNPVhr均具有復(fù)制原點(diǎn)功能[5]。家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）基因組含有8個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，其中hr3和hr5不僅在宿主細(xì)胞中具有復(fù)制原點(diǎn)功能，在AcMNPV感染的非宿主Sf21細(xì)胞中亦可得到復(fù)制，而且hr5在AcMNPV感染的Sf21細(xì)胞中的復(fù)制功能比在BmNPV感染的BmN細(xì)胞中高一些[6，10-11]，表明與AcMNPV復(fù)制有關(guān)的因子亦能作用于BmNPV的hrs。hr除具有復(fù)制原點(diǎn)的功能外，還具有早期基因表達(dá)增強(qiáng)子的功能。BmNPV ZJ-8株 hr3具有增強(qiáng)ie1和hel基因啟動(dòng)子活性的功能，其增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性分別高達(dá)2 400、7 000倍左右，即使僅含有hr3中1個(gè)典型完整的回文序列，其增強(qiáng)能力也高達(dá)79倍[12-13]。在Sf9細(xì)胞中，AcMNPVhr1序列除具有復(fù)制原點(diǎn)的功能外，還能夠增強(qiáng)多角體啟動(dòng)子和果蠅hsp70基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性[14]。

斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ型（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus Ⅱ，SpltNPVⅡ）基因組DNA含有7個(gè)hrs，前期研究證實(shí)7個(gè)hrs在宿主細(xì)胞Spli221中具有復(fù)制原點(diǎn)和增強(qiáng)子的功能[7]，本研究擬對(duì)SpltNPVⅡhr1進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，并采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）相結(jié)合的方法，探討hr1在非敏感宿主BmNPV-BmN和AcMNPV-Sf21細(xì)胞系統(tǒng)中是否具有復(fù)制原點(diǎn)和增強(qiáng)子的功能。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料和主要試劑

BmN和Sf21細(xì)胞均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。質(zhì)粒pBm-ie1P-hr1和pAc-ie1P-hr1分別含有BmNPVie1和AcMNPVie1啟動(dòng)子序列以及SpltNPVⅡ hr1序列，質(zhì)粒pUC19-hr1含有SpltNPVⅡ hr1序列，均為筆者所在研究室保存。寡核苷酸引物的合成由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基TC-100、胎牛血清及脂質(zhì)體（lipofectin）試劑均購自GIBCO公司。SYBR Green Ⅰ試劑購自Promega公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

BmN和Sf21細(xì)胞用含10%胎牛血清（FBS）的TC-100培養(yǎng)基在27 ℃按Summers等的方法[15]進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2SpltNPVⅡhr1序列分析

利用ClustalW、DNAMAN、Lasergene 7.1和MEGA 4等生物軟件對(duì)SpltNPVⅡ hr1序列進(jìn)行分析。

1.2.3脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞

接種約5×105個(gè)細(xì)胞于12 cm2 ?25 mL培養(yǎng)瓶中，貼壁培養(yǎng)過夜。除去含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗2次細(xì)胞，加入1 mL無血清培養(yǎng)基，接種野生型NPV病毒（感染復(fù)數(shù)=1），感染1 h。然后傾去培養(yǎng)基，加入3 mL 含血清的完全培養(yǎng)基，27 ℃培養(yǎng)2 h。移去上述完全培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗2次細(xì)胞，再加1 mL無血清培養(yǎng)基。事先在50 μL反應(yīng)體系中加入2 μg質(zhì)粒DNA和適量的lipofectin試劑，用ddH2O補(bǔ)足體積，輕輕混勻，27 ℃溫育15 min 使DNA被脂質(zhì)體包埋，制成轉(zhuǎn)染液。將轉(zhuǎn)染液逐滴加入培養(yǎng)瓶中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)混勻。轉(zhuǎn)染4～5 h后傾去含轉(zhuǎn)染液的無血清培養(yǎng)基，補(bǔ)加3 mL含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，27 ℃培養(yǎng)。

1.2.4瞬時(shí)表達(dá)分析

將功能質(zhì)粒pBm-ie1P-hr1和pAc-ie1P-hr1 DNA分別轉(zhuǎn)染野生型病毒BmNPV和AcMNPV感染的BmN和Sf21細(xì)胞或未感染細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，用細(xì)胞刮將貼壁細(xì)胞刮下，5 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞。加入適量磷酸緩沖液，重懸細(xì)胞后，5 000 r/min離心5 min，棄上清，如此反復(fù)清洗細(xì)胞2～3次。加入細(xì)胞裂解液將細(xì)胞重懸，裂解5～10 min，使之充分裂解。在每個(gè)樣品管中加入100 μL熒光素酶反應(yīng)底物，加入一定體積的細(xì)胞裂解混合液，振蕩混勻。將樣品放入熒光儀，按照設(shè)定程序開始測(cè)量讀數(shù)[16]。設(shè)置3組重復(fù)試驗(yàn)。以pRL-CMV質(zhì)粒作為內(nèi)參質(zhì)粒，以只含ie1啟動(dòng)子的pBm-ie1P和pAc-ie1P質(zhì)粒作對(duì)照。將牛血清白蛋白配制成標(biāo)準(zhǔn)濃度（0.5 mg/mL）蛋白質(zhì)，用酶標(biāo)儀進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測(cè)定。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR

將功能質(zhì)粒pUC19-hr1 DNA轉(zhuǎn)染野生型病毒BmNPV和AcMNPV感染的BmN和Sf21細(xì)胞。48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總DNA，經(jīng)DpnⅠ酶切后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR獲得的CT值及標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算功能質(zhì)粒在BmN和Sf21細(xì)胞中的拷貝數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1SpltNPVⅡhr1序列分析

SpltNPVⅡ hr1大小為1 746 bp，位于基因組127 816～130 509 bp、開放閱讀框（ORF）8～ORF9之間。hr1含6個(gè)64 bp 不完全回文序列（圖1），其序列的核苷酸一致性高達(dá)90%以上，回文序列的中心均含有1個(gè)PvuⅠ限制性酶切位點(diǎn)，含有4個(gè)正向重復(fù)序列，并且存在7個(gè)不規(guī)則重復(fù)序列和7個(gè)與病毒基因組DNA復(fù)制相關(guān)的motif基序（圖2）。

2.2SpltNPVⅡhr1對(duì)BmNPV和AcMNPVie1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)作用

采用脂質(zhì)體介導(dǎo)功能質(zhì)粒在昆蟲細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染與瞬時(shí)表達(dá)方法，將構(gòu)建的含有BmNPV和AcMNPVie1啟動(dòng)子以及SpltNPVⅡhr1的功能質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染感染野生型BmNPV和AcMNPV的BmN和Sf21細(xì)胞，以只含ie1啟動(dòng)子的pBmie1-P和pAc-ie1P質(zhì)粒作對(duì)照。結(jié)果顯示，SpltNPVⅡhr1在非敏感宿主細(xì)胞BmN中，增強(qiáng)BmNPVie1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的效率是對(duì)照的30倍，增強(qiáng)AcMNPVie1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的功能較強(qiáng)，其增強(qiáng)效率為對(duì)照的350倍（表1）。

將功能質(zhì)粒pUC19-hr1按照108～104個(gè)拷貝進(jìn)行梯度稀釋，作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。以所得CT值對(duì)相應(yīng)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)作圖，即得所需標(biāo)準(zhǔn)曲線及其線性方程y=ax+b，結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，r2>0.99（圖3）。

用含有SpltNPVⅡhr1的功能質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BmNPV和AcMNPV感染的BmN和Sf21細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總DNA，經(jīng)DpnⅠ酶切后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，將獲得的CT值代入圖3中制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出含有SpltNPVⅡhr1的功能質(zhì)粒在BmN和Sf21細(xì)胞中的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，SpltNPVⅡhr1在BmN細(xì)胞中的拷貝數(shù)為（8.46×104±6.13×103）copies/μg DNA，在Sf21細(xì)胞中的拷貝數(shù)為（5.92×106±2.95×105）copies/μg DNA。

3討論與結(jié)論

大多數(shù)桿狀病毒基因組都含有同源重復(fù)序列，分布于基因組的多個(gè)位置，具有基因組DNA復(fù)制起始原點(diǎn)和增強(qiáng)基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的雙重功能。本研究通過序列分析發(fā)現(xiàn)，SpltNPVⅡhr1具有作為病毒基因組DNA復(fù)制起始原點(diǎn)的特征結(jié)構(gòu)，并探討了SpltNPVⅡhr1在非敏感宿主BmN和Sf21細(xì)胞中是否具有復(fù)制起始原點(diǎn)以及增強(qiáng)BmNPVie1和AcMNPVie1基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的功能，發(fā)現(xiàn)hr1在2種非敏感宿主細(xì)胞中均具有復(fù)制起始原點(diǎn)和增強(qiáng)子功能，但復(fù)制和增強(qiáng)效率各不相同。在Sf21細(xì)胞中的復(fù)制和增強(qiáng)效率遠(yuǎn)高于在BmN細(xì)胞中，并且同樣處理?xiàng)l件下，在異源細(xì)胞中的復(fù)制和增強(qiáng)效率高于在宿主細(xì)胞Spli221中[7]。

胡建新等通過Southern雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，含BmNPVhr5的質(zhì)粒在AcMNPV-Sf細(xì)胞系統(tǒng)中的復(fù)制起始原點(diǎn)功能要比在BmNPV-BmN細(xì)胞系統(tǒng)中高一些[11]。Chen等曾報(bào)道，BmNPVhr3具有增強(qiáng)BmNPVie1和AcMNPVie1基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的功能，并且在異源Sf21細(xì)胞中的增強(qiáng)作用遠(yuǎn)高于宿主細(xì)胞BmN[13]。這可能是由于細(xì)胞轉(zhuǎn)化和感染方法等都是仿照細(xì)胞Sf21/AcMNPV系統(tǒng)所采用的方法，對(duì)于其他細(xì)胞株來說可能不是最適合的條件。張志芳等研究發(fā)現(xiàn)，BmNPVhr3和hr5與AcMNPV同源性高達(dá)90%以上，并且在AcMNPV感染的Sf21細(xì)胞中均能得到顯著復(fù)制，推測(cè)hr作為病毒復(fù)制起始原點(diǎn)與其結(jié)構(gòu)以及所需病毒因子的同源性可能有關(guān)[6，11]。

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