姚洪偉 商照聰 舒耀皋

摘要：通過測定土霉素對10種經(jīng)濟(jì)作物（小白菜、甘藍(lán)、洋蔥、大白菜、生菜、菜豆、玉米、豇豆、黃瓜和白蘿卜）的種子發(fā)芽率、根伸長、芽伸長和生物量的影響，以期為土壤-植物系統(tǒng)中土霉素污染的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險評價提供依據(jù)。結(jié)果表明，在9.38～293.15 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，10種種子的發(fā)芽率與土霉素濃度之間劑量-效應(yīng)關(guān)系不明顯;土霉素對10種試驗種子的根伸長抑制率、芽伸長抑制率和生物量抑制率之間存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，指標(biāo)敏感性表現(xiàn)為根伸長>芽伸長>生物量>發(fā)芽率;以半最大效應(yīng)濃度（EC50）為判斷依據(jù)，對所選植物種子的根伸長抑制效應(yīng)表現(xiàn)為菜豆>白蘿卜>玉米>甘藍(lán)>豇豆>洋蔥>小白菜>生菜>大白菜>黃瓜;根伸長抑制率可作為土霉素對種子毒性的敏感性指標(biāo)，能反映種子被四環(huán)素類抗生素污染的狀況。

關(guān)鍵詞：土霉素;經(jīng)濟(jì)作物;種子;根伸長;芽伸長;生物量;回歸方程

中圖分類號： X171.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）21-0313-05

收稿日期：2018-07-31

基金項目：上海市國資委企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新和能級提升項目（編號：2016006）。

作者簡介：姚洪偉（1987—），女，山東菏澤人，碩士，工程師，研究方向為環(huán)境安全評價研究。E-mail：yaohanyhw2@163.com。

通信作者：舒耀皋，碩士，高級工程師，研究方向為環(huán)境安全評價研究。E-mail：syg@ghs.cn。

近年來，水源水和飲用水中逐漸檢測出了新興痕量污染物——藥品和個人護(hù)理用品（PPCPs）[1-2]。國外已有研究表明，多種PPCPs對人類及其他生物具有生殖、神經(jīng)、肝腎毒性等毒理學(xué)效應(yīng)或具有致癌可能性[3]。土霉素是一種典型的PPCPs藥物，具有廣譜抗病原微生物作用，在全世界被廣泛使用。我國是土霉素生產(chǎn)和使用大國，2003年土霉素產(chǎn)量就達(dá)到1萬t，占世界總產(chǎn)量的65%[4]。土霉素的大量使用使其在自然環(huán)境中的殘留日趨嚴(yán)重[5]，代謝產(chǎn)物可能過量蓄積并儲存于動物的細(xì)胞和組織器官中，人們通過食攝取可能會引起體內(nèi)病變[6]。Wollenberger等研究表明，環(huán)境中殘留的土霉素對水生動物具有不良的生態(tài)毒理效應(yīng)[7]。

土壤（或沉積物）是抗生素等污染物質(zhì)的最終歸宿之地，進(jìn)入環(huán)境中的抗生素將在土壤（或沉積物）中積累，必定對土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生一定的影響[8]。目前，土霉素的生態(tài)毒理研究還主要集中在水體、沉積物、污泥中的分布特征以及土霉素對各種生物影響的劑量關(guān)系上，涉及的生物主要有魚、蚯蚓、老鼠等，對于其在土壤-植物系統(tǒng)中的毒性效應(yīng)研究還很少[9-10]。土壤作為陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，研究植物-土霉素的相互作用對于毒理學(xué)和植物學(xué)具有重要的現(xiàn)實意義。

2017年6—10月，在上?；ぱ芯吭河邢薰经h(huán)境安全評價實驗室完成試驗。本研究以土霉素為目標(biāo)污染物，選用與人們?nèi)粘Ｉ蠲芮邢嚓P(guān)的10種經(jīng)濟(jì)作物種子，參照標(biāo)準(zhǔn)測試方法[11-13]，考察土霉素對植物種子的發(fā)芽和根伸長的抑制效應(yīng)，以期為土壤-植物系統(tǒng)中土霉素污染的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險評價提供依據(jù)，并為土霉素污染耕地的植物生態(tài)修復(fù)提供數(shù)據(jù)支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1土霉素

土霉素為分析純，純度在99%以上，購自內(nèi)蒙古格林特制藥有限責(zé)任公司。

1.1.2試驗用種子

根據(jù)《化學(xué)品測試方法生物系統(tǒng)效應(yīng)卷》[12]和《國家環(huán)境保護(hù)局化學(xué)品測試準(zhǔn)則》[13]推薦，共選用10種經(jīng)濟(jì)作物種子，種子來源等情況見表1。

試驗時挑選大小一致、顆粒飽滿、粒徑相同、未破損的種子進(jìn)行試驗。

1.1.3試驗用基質(zhì)

選用惰性材料石英砂（粒徑為40～100 μm）作為試驗基質(zhì)，試驗前用7.5 mol/L硝酸清洗，并用NaOH溶液以及蒸餾水漂洗，清洗后石英砂的pH值為中性。

1.1.4儀器設(shè)備

LC-20AD型高效液相色譜儀，購自日本島津儀器公司;ME204E型電子天平、ME2002E型電子天平，購自METTLER TOLEDO;RXZ-1500B型人工氣候箱，購自寧波江南儀器廠;A1000型培養(yǎng)箱，購自加拿大CONVIRON;Multi 3420型便攜式水質(zhì)分析儀，購自德國WTW;90-1B型強(qiáng)力磁力攪拌器，購自上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;300 mm型鋼直尺，購自寧波長城精工實業(yè)有限公司;HD2010W型電動攪拌器，購自上海司樂儀器有限公司;溫濕度記錄儀，購自ZOGLAB;移液器，購自艾本德中國有限公司;直徑為150 mm的玻璃培養(yǎng)皿、燒杯、量筒等，均購自海門市華凱實驗玻璃儀器廠。

1.2試驗方法

通過預(yù)試驗確定10種種子發(fā)芽率和根伸長的半最大效應(yīng)濃度（EC50），以此為依據(jù)開展正式試驗。對每種植物的試驗，設(shè)置6個按幾何級數(shù)設(shè)置的不同處理質(zhì)量濃度，其處理質(zhì)量濃度比率在1.5～2.0之間，設(shè)定質(zhì)量濃度分別為9.38、18.75、 37.50、7500、150.00、293.15 mg/L?并設(shè)置1個空白對照組（用去離子水替代土霉素溶液）。每個培養(yǎng)皿加入500 g石英砂和130 mL 試驗溶液，混勻，放入10粒種子。對照組加入去離子水，每1處理濃度組和對照組各設(shè)置3次重復(fù)，每個重復(fù)用10粒種子。將培養(yǎng)皿放入人工氣候箱中，人工氣候箱溫度設(shè)定為25 ℃，濕度為75%，并保持黑暗。

在使用前，測定各試驗溶液質(zhì)量濃度并測定其pH值。試驗過程中觀察種子的發(fā)芽和生長情況。當(dāng)對照組種子發(fā)芽率在65%以上，根伸長長度為20 mm時，結(jié)束試驗。

1.2.1土霉素質(zhì)量濃度測定

用島津LC-20AD型高效液相色譜儀測定水溶液中的土霉素含量，液相色譜測定條件如下：選擇Waters Atlantis T3柱，4.6×150 mm，5 μm色譜柱;檢測器：二極管陣列檢測器（DAD）;進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為30 ℃，流動相采用38%甲醇：72%水（含0.1%甲酸），流速為1.0 mL/min，檢測波長為268 nm，運(yùn)行時間為5 min。該色譜條件下，土霉素的保留時間為3.15 min。按外標(biāo)法以每個濃度的平均峰面積對照樣品質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸，得回歸線性方程為y=7 654.23x，r2=0.991 4。

1.2.2指標(biāo)測定

試驗期間，每24 h記錄1次發(fā)芽種子數(shù)并補(bǔ)充溶液保持濕度，7 d時調(diào)查菜豆、玉米、豇豆、黃瓜和白蘿卜的發(fā)芽率和生長情況，14 d時調(diào)查小白菜、甘藍(lán)、洋蔥、大白菜和生菜的發(fā)芽率和生長情況，其中生長情況為測量各發(fā)芽種子的根伸長、芽伸長和生物量。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)以3次重復(fù)的平均值表示，利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用概率單位方法對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，得到10種植物的發(fā)芽率、根伸長抑制率、芽伸長抑制率和生物量抑制率的EC50及其95%置信區(qū)間。

2結(jié)果與分析

2.1土霉素化學(xué)分析

稱取0.020 1 g土霉素，用甲醇和水（兩者體積比為1 ∶1，含0.1% 甲酸）的混合溶液定容至50 mL，得質(zhì)量濃度為400 mg/L 的儲備液。將儲備液稀釋成質(zhì)量濃度為4、8、16、40、80、160 mg/L的溶液，重復(fù)進(jìn)樣2次。按外標(biāo)法以每個濃度的平均峰面積對照樣品濃度進(jìn)行回歸，得回歸線性方程為y=7 654.23x，r2=0.991 4。

將4 mg/L測出的信號與基線噪音信號高度進(jìn)行比較，得出S/N=195.32，進(jìn)樣體積為5 μL，以3倍基線噪音得出儀器對該樣品的最小檢測限（LOD）為0.061 mg/L;以10倍基線噪音得出相應(yīng)最低定量限（LOQ）為0.20 mg/L。

試驗開始時測定試驗溶液的質(zhì)量濃度，實測質(zhì)量濃度分別為9.38、18.75、37.50、75.00、150.00、293.15 mg/L，實測質(zhì)量濃度均在設(shè)定質(zhì)量濃度的80%～120%之間，因此質(zhì)量濃度以實測質(zhì)量濃度計。

2.2土霉素對10種種子發(fā)芽率、根伸長、芽伸長和生物量的影響

2.2.1土霉素對10種種子發(fā)芽率的影響

發(fā)芽率在一定程度上反映了土霉素對該植物種子的毒性大小。被土霉素處理過的種子發(fā)芽率越低，說明該種子對土霉素的耐受性越弱，毒性越大，反之耐受性越強(qiáng)，毒性越小。從圖1可以看出，經(jīng)不同質(zhì)量濃度土霉素處理后，10種種子的發(fā)芽率與對照組相比均無明顯差異。

2.2.2土霉素對10種種子根伸長的影響

通過圖2可以看出，當(dāng)土霉素污染水平為0～9.38mg/L時，對小白菜、甘藍(lán)、大白菜、玉米、豇豆等種子的根伸長均有促進(jìn)作用，0～18.75 mg/L 時對生菜和黃瓜種子根伸長生長均有促進(jìn)作用，當(dāng)土霉素的質(zhì)量濃度為37.50 mg/L時開始出現(xiàn)抑制作用，隨著土霉素質(zhì)量濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，293.15 mg/L時對生菜、黃瓜等種子的根伸長生長抑制率分別為75.00%、6000%。對洋蔥、菜豆、白蘿卜等種子的根伸長生長均有抑制作用，且與對照相比有顯著差異（P<0.05），隨著土霉素污染水平的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)土霉素的質(zhì)量濃度為293.15 mg/L時對洋蔥、菜豆、白蘿卜等種子的根伸長生長抑制率分別為7300%、78.13%、81.60%。

2.2.3土霉素對10種種子芽伸長的影響

由圖3可知，當(dāng)土霉素污染水平為0～9.38 mg/L時，對洋蔥、菜豆、黃瓜等種子的芽伸長均有促進(jìn)作用，18.75 mg/L時開始出現(xiàn)抑制作用，293.15 mg/L 時對三者的抑制率分別為44.52%、7346%、82.60%。對小白菜、甘藍(lán)、大白菜、生菜、玉米、豇豆、白蘿卜等芽伸長的抑制率隨著土霉素質(zhì)量濃度的增加逐漸增強(qiáng)，293.15 mg/L時抑制率分別為63.80% 、68.58%、69.41、37.56%、58.25%、81.11%、53.92%。

2.2.4土霉素對根伸長和芽伸長抑制率的回歸方程和EC50結(jié)果

土霉素對根伸長和芽伸長的抑制效應(yīng)通過SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到回歸方程和EC50。

通過表2可以看出，土霉素對10種種子根伸長的毒性效應(yīng)不同，以根伸長EC50為判斷依據(jù)，對所選植物種子的抑制效應(yīng)表現(xiàn)為菜豆>白蘿卜>玉米>甘藍(lán)>豇豆>洋蔥>小白菜> 生菜>大白菜>黃瓜。

土霉素對10種種子芽伸長的毒性效應(yīng)不同，以芽伸長EC50為判斷依據(jù)，對所選植物種子的抑制效應(yīng)表現(xiàn)為大白菜>甘藍(lán)>豇豆>黃瓜>菜豆>白蘿卜>小白菜>洋蔥>玉米>生菜。

2.2.5土霉素對10種種子生物量的影響

由圖4可以看出，土霉素對10種種子生物量的毒性效應(yīng)不同，低質(zhì)量濃度土霉素對小白菜、甘藍(lán)、菜豆、玉米、豇豆、黃瓜等種子的生物量均有促進(jìn)作用，高質(zhì)量濃度有抑制作用，且隨著濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。 其中土霉素污染水平為150.00 mg/L以下時對玉米種子的生物量有促進(jìn)作用，9.38 mg/L時促進(jìn)率達(dá)103.39%，293.15 mg/L時開始有抑制效應(yīng)，抑制率為1239%;當(dāng)土霉素污染水平為0～37.50 mg/L時，對小白菜、黃瓜等種子的生物量均有促進(jìn)作用。隨著土霉素質(zhì)量濃度的增加，對洋蔥、大白菜、生菜、白蘿卜等種子的生物量的抑制作用逐漸增大。

土霉素對10種種子生物量的影響，物種間存在顯著差異（P<0.05），但試驗處理間的差異不顯著。如小白菜，在1875、37.50、75.00 mg/L質(zhì)量濃度下與對照無顯著差異，在150.00、293.15 mg/L質(zhì)量濃度下與對照差異顯著（P<0.05）;甘藍(lán)、生菜和菜豆的生物量在土霉素各質(zhì)量濃度污染水平下均無顯著性差異。

3討論與結(jié)論

3.1討論

田智宇等采用水培和土培的方法研究土霉素藥渣對典型植物發(fā)芽影響時發(fā)現(xiàn)，土霉素廢渣或土霉素堿溶液中的土霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)<25 mg/kg時，黃瓜種子的發(fā)芽率與對照相比均無顯著差異[14];陳博陽等研究土霉素對玉米種子發(fā)芽的影響顯示，30 mg/L土霉素對玉米發(fā)芽均有顯著促進(jìn)作用[15]，本研究結(jié)果與之不同，原因為30 mg/L質(zhì)量濃度較低，處于對種子發(fā)芽的促進(jìn)階段，未達(dá)到土霉素對種子產(chǎn)生毒害的閾值?？赡苁怯捎诜N子發(fā)芽過程主要受胚內(nèi)養(yǎng)分供應(yīng)，并受到種皮對種子的保護(hù)，從而受外界物質(zhì)影響較小[16]，另外由于抗生素等新型污染物的毒性不如工業(yè)化學(xué)品那樣劇烈，導(dǎo)致土霉素污染對種子發(fā)芽的毒害作用被部分掩蓋，因此，種子發(fā)芽率不適宜作為土霉素污染對植物種子生態(tài)毒理學(xué)的敏感指標(biāo)[17]。

林匡飛等研究硒對小麥種子發(fā)芽與根伸長抑制效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)按EC25比較，根長抑制率>根干質(zhì)量抑制率>莖葉長抑制率>發(fā)芽抑制率，且對根生長抑制最為敏感，認(rèn)為根伸長抑制率可作為土壤污染的生物指示物[18]。Bradel等研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素可以通過抑制植原體的活性而影響幼芽分枝[19]。這些都有可能成為土霉素污染脅迫下植物幼苗生長受限制的原因。

土霉素對10種種子芽伸長與根伸長的影響整體趨勢相一致，但抑制率大小不同，對根的生長抑制率稍大于芽伸長。相對于對芽伸長的抑制結(jié)果，土霉素對植物種子的根伸長抑制程度較為明顯。Cheng等研究表明，有機(jī)化合物在相同質(zhì)量濃度下對植物幼苗根長的抑制效應(yīng)大于其他參數(shù)[20]。這是由于種子萌發(fā)時向周圍環(huán)境吸水膨脹的同時，受到土霉素不同強(qiáng)度的脅迫，引起決定種子萌芽力的下降，導(dǎo)致種子萌芽率低，生長遲緩。

土霉素對種子發(fā)芽和生長的影響還與作物種類有關(guān)。本研究中，菜豆種子對土霉素的耐性最差，18.75 mg/L時，土霉素對菜豆根長的抑制率已經(jīng)達(dá)到了47.32%，相同濃度的土霉素對白蘿卜根長和芽伸長的抑制率均大于玉米種子，因此，土霉素對作物種子發(fā)芽和根長抑制作用的強(qiáng)弱與作物種類相關(guān)，但與作物種子粒徑大小關(guān)系不確定，這同侯俊杰等研究茶皂素對種子發(fā)芽、根長的影響結(jié)論[21]相一致。

Migliore等研究發(fā)現(xiàn)，恩諾沙星對黃瓜、生菜、白蘿卜的生長有促進(jìn)效應(yīng)，即在低濃度時促進(jìn)植物生長，而在高濃度時抑制植物的生長[22-24]。林琳等研究土壤四環(huán)素污染脅迫下小白菜、大白菜幼苗的生長試驗，結(jié)果表明，土壤四環(huán)素污染對小白菜、大白菜幼苗的生長毒性表現(xiàn)為根長﹥ 鮮質(zhì)量﹥莖長[25]。本研究結(jié)果基本與Migliore、林琳等的研究結(jié)果[22-25]相一致。

綜上所述，經(jīng)土霉素不同質(zhì)量濃度處理后，對于供試的10種植物種子來說雖然發(fā)芽率沒有明顯變化，但發(fā)芽勢和種子表現(xiàn)出來的活力卻有較明顯的不同，這可能是因為植物在發(fā)芽過程中，環(huán)境中的抗生素殘留將會對種子萌發(fā)尤其是發(fā)芽后的生長產(chǎn)生影響。

種子發(fā)芽和根伸長毒性是主要的高等植物毒理試驗方法，這些試驗方法可通過植物種子在污染條件下種子發(fā)芽情況、根系生長狀況、芽生長情況和整體生物量來診斷化學(xué)物質(zhì)對植物胚胎發(fā)育影響的程度。一般認(rèn)為，化學(xué)品對種子的影響存在一個較低濃度下促進(jìn)效應(yīng)和高濃度下的抑制效應(yīng)。本試驗的結(jié)果在設(shè)定的土霉素處理范圍內(nèi)，各種子發(fā)芽、根伸長、芽伸長和生物量的變化趨勢符合上述規(guī)律。

3.2結(jié)論

本研究以土霉素為目標(biāo)污染物，選用與人們?nèi)粘Ｉ蠲芮邢嚓P(guān)的10種經(jīng)濟(jì)作物種子，考察土霉素對植物種子的發(fā)芽和根伸長的抑制效應(yīng)，試驗結(jié)果表明，（1）與對照組對比，土霉素在9.38、18.75、37.50、75.00、150.00、293.15 mg/L質(zhì)量濃度下對10種種子的發(fā)芽率影響不顯著。

（2）土霉素對各種植物種子的發(fā)芽率、根伸長、芽伸長和生物量的毒性效應(yīng)存在差別，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，土霉素毒性與種子的發(fā)芽率、根伸長抑制率、芽伸長抑制率和生物量抑制率之間存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，指標(biāo)敏感性表現(xiàn)為根伸長>芽伸長>生物量>發(fā)芽率。

（3）以EC50為判斷依據(jù)，土霉素對10種種子根伸長的毒性效應(yīng)表現(xiàn)為菜豆>白蘿卜>玉米>甘藍(lán)>豇豆>洋蔥>小白菜> 生菜>大白菜>黃瓜;對芽伸長的毒性效應(yīng)表現(xiàn)為大白菜>甘藍(lán)>豇豆>黃瓜>菜豆>白蘿卜>小白菜>洋蔥>玉米>生菜。

（4）土霉素對植物種子的根伸長抑制程度較為明顯，因此根伸長可以作為評價土霉素生態(tài)毒性效應(yīng)的一個較為敏感的指標(biāo)。在被土霉素污染的耕地中，在其他條件如溫度、氣候等均滿足的情況下，作物種類耕種的選擇應(yīng)綜合考慮土霉素對根伸長和芽伸長的脅迫效應(yīng)。

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