路芳芳 翁震 何楊

215006 江蘇省血液研究所 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院

外泌體(exosomes)是由細(xì)胞衍生的囊泡，1983年首次由Pan和Johnstone[1]在哺乳動(dòng)物成熟的網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。它是一種微小膜泡，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，內(nèi)部包含蛋白質(zhì)和核酸等多種物質(zhì)[2]。大多數(shù)細(xì)胞，如間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、單核/巨噬細(xì)胞和心肌細(xì)胞等均能釋放大小、組成及功能不同的外泌體。它可參與細(xì)胞間通訊、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和交換等生理過(guò)程，故能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的作用。不僅如此，近年研究表明外泌體還參與到多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，包括腫瘤、機(jī)體免疫應(yīng)答、神經(jīng)退行性疾病和代謝綜合征等。

在心血管疾病中，有關(guān)外泌體的研究進(jìn)展迅速，多項(xiàng)研究表明它能夠參與到各種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，特別是在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)、心力衰竭和心肌梗死等病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。外泌體自身的組分會(huì)隨著胞內(nèi)物質(zhì)的釋放及內(nèi)環(huán)境的變化而發(fā)生特異性的改變，這些特征為其作為疾病的診斷工具提供了可能性。此外，近年研究發(fā)現(xiàn)各種干細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞等衍生的外泌體在促進(jìn)血管再生和修復(fù)受損心臟等方面發(fā)揮著重要的作用。本文主要對(duì)外泌體的產(chǎn)生和其對(duì)心血管疾病的診斷和治療作用方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體的生成

外泌體由晚期的核內(nèi)體生成，隨后通過(guò)許多不同的途徑形成多泡體，其中最典型的是ESCRT依賴途徑。ESCRT能夠識(shí)別泛素化的蛋白質(zhì)，目前已知有4種不同的ESCRT復(fù)合物。ESCRT-0復(fù)合物的亞基能夠招募內(nèi)化的蛋白質(zhì)，如泛素化蛋白質(zhì)和網(wǎng)格蛋白等。ESCRT-1和-2決定萌芽過(guò)程的開始，能促進(jìn)所攜帶的蛋白在腔內(nèi)囊泡形成之前進(jìn)行去泛素化，然后腔內(nèi)囊泡在細(xì)胞內(nèi)隔室中形成更大的多泡體。ESCRT-3復(fù)合物驅(qū)動(dòng)最后階段的膜內(nèi)陷和分離[3- 4]，之后通過(guò)胞吐作用形成外泌體。外泌體可通過(guò)兩種機(jī)制從細(xì)胞釋放：組成型或誘導(dǎo)型。組成型分泌途徑受某些RAB小G蛋白(Rab27a/b，Rab11和Rab35)、異源三聚體G蛋白、WNT5A和糖鞘脂等調(diào)節(jié)[5]；而誘導(dǎo)型分泌受應(yīng)激刺激的調(diào)節(jié)，包括異常細(xì)胞內(nèi)鈣釋放、DNA損傷、缺氧和脂多糖等的刺激[6-7]。此外，Gu等[8]的研究表明，在造血干細(xì)胞中，空泡蛋白分選蛋白33B能夠調(diào)節(jié)外泌體的分泌和成熟以及外泌體內(nèi)蛋白的分泌，從而影響造血干細(xì)胞的功能和白血病的發(fā)生。進(jìn)一步的研究表明，外泌體的作用機(jī)制是通過(guò)空泡蛋白分選蛋白33B與鳥苷二磷酸分解抑制劑2相互作用共同完成的。

2 外泌體在心血管疾病中的診斷和治療作用

外泌體在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中都具有重要作用。近年廣泛開展了有關(guān)外泌體在腫瘤的診斷和治療、靶向給藥及心血管疾病的診斷和治療中的作用研究。在心血管疾病中，迄今為止，大多數(shù)研究主要集中在源自體外培養(yǎng)的多能細(xì)胞產(chǎn)生的外源外泌體的功能上。關(guān)于內(nèi)源性外泌體的作用，近來(lái)已有文獻(xiàn)報(bào)道，來(lái)自血清的外泌體可以防止心肌缺血-再灌注損傷[9]。為了闡明血清外泌體在急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)中是否也有類似作用，Gu等[10]建立了新生大鼠原代心肌細(xì)胞氧-葡萄糖剝奪和再灌注模型，將純化的人或小鼠血清外泌體與大鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)外泌體能顯著減弱缺氧缺葡萄糖引起的心肌細(xì)胞凋亡。體內(nèi)小鼠AMI模型也證實(shí)，血清外泌體可以通過(guò)增加miR-21的表達(dá)來(lái)減少小鼠心肌梗死面積[11]。此外，Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)，血清外泌體可通過(guò)miR-939-iNOS-NO途徑促進(jìn)心肌缺血患者的血管生成。

2.1 外泌體在心血管疾病中的診斷作用

2.1.1 AS AS是一種慢性炎癥性疾病。在AS形成期間，外泌體攜帶有來(lái)自其親本細(xì)胞的表面分子及特定的胞質(zhì)內(nèi)含物，根據(jù)這些表面分子和內(nèi)含物的不同，外泌體可以作為AS診斷和預(yù)后的生物標(biāo)記物。最新研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化性腦血管疾病患者血漿中的內(nèi)皮細(xì)胞和血小板衍生的外泌體含量顯著升高，其中的蛋白質(zhì)如血小板糖蛋白Ⅵ、整合素連接激酶1等也會(huì)發(fā)生改變，這對(duì)AS具有潛在的診斷價(jià)值[13-14]。Fichtlscherer等[15]報(bào)道，與健康對(duì)照組相比，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者的外泌體中miR-126、炎癥相關(guān)miR-155和平滑肌富集miR-145降低。Bi等[16]研究表明，AS進(jìn)展為急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)后，患者的血清外泌體中miR-208a表達(dá)顯著上調(diào)，并且這部分患者的生存率降低，提示外泌體miR-208a可能有助于ACS的早期診斷和預(yù)后判斷。此外，不穩(wěn)定斑塊患者血循環(huán)中白細(xì)胞衍生的外泌體水平的增加可作為提示斑塊易感性的指標(biāo)，并能夠鑒別具有高風(fēng)險(xiǎn)斑塊破裂的無(wú)癥狀個(gè)體(CD11b+/CD66+外泌體)[17]或預(yù)測(cè)未來(lái)不良心血管事件的發(fā)生(CD3+/CD45+外泌體)[18]。

2.1.2 心肌梗死 心肌梗死是冠心病的嚴(yán)重類型，可造成心肌細(xì)胞不可逆的損傷，最終導(dǎo)致心力衰竭。心肌梗死患者血液中的外泌體miRNA可作為心血管疾病診斷的生物標(biāo)記物。Min等[19]研究發(fā)現(xiàn)，ST段抬高型心肌梗死患者冠狀動(dòng)脈內(nèi)和全身循環(huán)微泡水平升高，在經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療后，局部增加的內(nèi)皮和血小板衍生的微泡水平顯著降低，進(jìn)一步表明循環(huán)微泡水平可反映心肌梗死情況。另有研究證實(shí)，AMI患者的血清外泌體中miR-30a水平升高，HIF-1α在缺氧條件下上調(diào)[20]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，心肌梗死小鼠模型中miR-1和miR-133a的水平明顯降低，這些miRNAs可能是心肌梗死早期診斷的標(biāo)記[21]。Cheng等[22]在AMI大鼠的尿外泌體中檢測(cè)到心臟富集的特異性miR-1和miR-208，表明心肌梗死發(fā)生后，外泌體可能從心臟轉(zhuǎn)移到了腎臟然后進(jìn)入尿液，這為AMI的診斷又提供了一組潛在的尿液生物標(biāo)記物。

2.1.3 心力衰竭 AMI不斷發(fā)展，導(dǎo)致大量的心肌細(xì)胞死亡并最終發(fā)展為心力衰竭。Goren等[23]和Tian等[23-24]的研究報(bào)道，特異性miRNA如miR-423-5p、miR-27a、miR-28-3p和miR-92b水平升高，可用于鑒別收縮性心力衰竭。另有證據(jù)表明，特定的外泌體相關(guān)miRNA對(duì)心力衰竭具有調(diào)節(jié)作用[25]。為了鑒定可以作為患者AMI后缺血性心力衰竭的可靠預(yù)測(cè)因子的循環(huán)miRNA，Matsumoto等[25]篩查了AMI后1年內(nèi)發(fā)生缺血性心力衰竭的21例患者，在被檢測(cè)的377個(gè)miRNAs中，僅有循環(huán)p53反應(yīng)性miRNAs，包括miR-192、miR-194和miR-34a的水平顯著上調(diào)。此外還發(fā)現(xiàn)，miR-192、miR-194和miR-34a在外泌體組分中高度富集，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示基于外泌體的循環(huán)p53反應(yīng)性miRNAs(miR-192、miR-194和miR-34a)可能是AMI后發(fā)生缺血性心力衰竭的預(yù)測(cè)因子。

2.2 外泌體對(duì)心血管疾病的治療潛力

2.2.1 MSCs來(lái)源的外泌體 MSCs是一類多能干細(xì)胞，存在于骨髓、肌肉等多種組織中。MSCs衍生的外泌體通過(guò)其內(nèi)容物中的蛋白質(zhì)、RNA等成分的胞間轉(zhuǎn)移來(lái)促進(jìn)組織修復(fù)和血管新生。目前研究表明，人胎盤來(lái)源的MSCs釋放的外泌體中含有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和miR-126，能夠促進(jìn)血管生成，特別是在一氧化氮刺激下，其促進(jìn)血管生成的能力顯著增強(qiáng)[26]。Lai等[27]研究發(fā)現(xiàn)，人類MSCs分泌的外泌體在缺血/再灌注損傷的小鼠離體模型中減少了心肌梗死面積。進(jìn)一步的研究表明，在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，用MSCs來(lái)源的外泌體進(jìn)行全身預(yù)處理后，顯著提高了ATP和NADH的水平，減少了心臟組織中的氧化應(yīng)激。Jill等[28]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓MSCs來(lái)源的外泌體能夠有效治療輻射導(dǎo)致的造血功能衰竭，而這種作用不依賴于造血干細(xì)胞移植。Cheng等[29]將MSCs的細(xì)胞膜包被到負(fù)載MSCs分泌因子的PLGA顆粒(一種可降解的生物相容性材料)上，制成一種性質(zhì)穩(wěn)定的人造MSCs外泌體，將其注射到小鼠AMI模型中，發(fā)現(xiàn)其能夠促進(jìn)血管生成并減輕左心室重構(gòu)。

2.2.2 血小板來(lái)源的外泌體 血小板在體內(nèi)主要發(fā)揮生理性止血和促進(jìn)血栓形成的作用，但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，血小板活化后衍生的外泌體具有抑制新生內(nèi)膜和血栓形成的作用。Mause等[30]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血小板衍生的外泌體與血管早期生長(zhǎng)細(xì)胞相互作用，從而促進(jìn)內(nèi)皮再生和抑制血管損傷后新生內(nèi)膜的形成，這提示其可能對(duì)AS和血管再狹窄等具有治療潛力。其主要機(jī)制涉及增強(qiáng)血管早期生長(zhǎng)細(xì)胞募集、遷移、分化和釋放促血管生成因子。此外，血小板衍生的外泌體還能抑制血栓形成。Srikanthan等[31]研究發(fā)現(xiàn)，激活的血小板衍生的外泌體可通過(guò)增強(qiáng)CD36的泛素化和蛋白酶體降解來(lái)快速減少血小板中的Ⅱ型清道夫受體CD36，導(dǎo)致血小板聚集的減弱和離體膠原基質(zhì)的粘附，并抑制FeCl3介導(dǎo)的動(dòng)脈損傷模型的血栓形成。已知miR-126是調(diào)節(jié)血管生成的最重要的miRNAs之一。Sun等[32]通過(guò)對(duì)ACS患者斑塊內(nèi)血小板外泌體水平的探討，發(fā)現(xiàn)活化的血小板衍生的外泌體能促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，以及miR-126和血管生成因子的過(guò)表達(dá)，從而闡明了斑塊內(nèi)血管生成的潛在治療靶點(diǎn)。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，血小板來(lái)源的外泌體會(huì)選擇性釋放一種環(huán)狀RNA[33]，提示除miRNA外，還有另一種RNA也參與到了與血小板有關(guān)的病理生理過(guò)程中，血小板外泌體環(huán)狀RNA的診斷和治療潛力值得進(jìn)一步研究。

2.2.3 內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體 內(nèi)皮細(xì)胞釋放的外泌體對(duì)血管生成和炎癥具有重要的調(diào)節(jié)作用。已有研究表明，通過(guò)將miR-126-3p和pSTAT轉(zhuǎn)移到受體內(nèi)皮細(xì)胞中導(dǎo)致ERK1-/-2活化，內(nèi)皮衍生的外泌體可以促進(jìn)血管生成[34]。與此相一致的是，外泌體還可通過(guò)旁分泌調(diào)節(jié)相鄰內(nèi)皮細(xì)胞增加血管生成，并通過(guò)β1-整合素途徑Rac1-ERK1-/-2ETS1發(fā)出信號(hào)以形成新的血管[35]。目前發(fā)現(xiàn)，幾種miRNAs可能通過(guò)抑制促炎性核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)轉(zhuǎn)錄通路，發(fā)揮調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能和抑制血管炎癥的作用。例如，miR-146a靶向銜接蛋白以抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)[36]，而miR-10a抑制NF-κB不穩(wěn)定蛋白的表達(dá)[37]。這些miRNAs可能在抑制內(nèi)皮細(xì)胞激活中起到互補(bǔ)作用。值得注意的是，血管內(nèi)皮細(xì)胞募集循環(huán)單核細(xì)胞到血管損傷和(或)感染的區(qū)域[38]，進(jìn)入血管壁后，單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，通過(guò)釋放外泌體以驅(qū)動(dòng)炎癥反應(yīng)來(lái)中和入侵的病原體，修復(fù)組織損傷或激活免疫細(xì)胞[38]。

2.2.4 其他細(xì)胞來(lái)源的外泌體 除上述幾種細(xì)胞來(lái)源的外泌體外，其他一些細(xì)胞衍生的外泌體也在心血管疾病中顯示出重要的治療潛力。例如，樹突狀細(xì)胞來(lái)源的外泌體可通過(guò)內(nèi)分泌機(jī)制介導(dǎo)CD4+T細(xì)胞的活化，改善心肌梗死后的心臟功能[39]；細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)源的外泌體攜帶的miR-199a-3p通過(guò)抑制同源域蛋白(HOPX)表達(dá)和增加GATA結(jié)合4(Gata4)乙酰化，促進(jìn)分離的新生兒心肌細(xì)胞和竇結(jié)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)。在竇性淋巴結(jié)功能障礙的動(dòng)物模型中，miR-199a-3p可以改善心肌細(xì)胞的電生理功能[40]；脂肪細(xì)胞來(lái)源的外泌體可通過(guò)調(diào)節(jié)泡沫細(xì)胞的形成和極化而發(fā)揮致AS的作用[41]。

3 小結(jié)與展望

綜上所述，外泌體可作為一種指示子來(lái)反映AS和心肌梗死等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展和嚴(yán)重程度。此外，干細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞等釋放的外泌體在促進(jìn)血管生成、改善心肌梗死和抗AS中發(fā)揮著重要作用。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的提出，越來(lái)越多的人開始關(guān)注如何能做到疾病的精確診斷和治療。各種證據(jù)表明，外泌體有望成為疾病診斷治療的潛在有效方式。外泌體中含有miRNA等多種內(nèi)含物，很多內(nèi)含物對(duì)機(jī)體的作用還有待進(jìn)一步研究，應(yīng)從外泌體的分離和提純?nèi)胧?，進(jìn)一步優(yōu)化外泌體的提純方法，以便為后續(xù)的鑒定和功能的研究提供良好的基礎(chǔ)，使外泌體早日應(yīng)用于心血管疾病的臨床診斷和治療。

利益沖突：無(wú)