李紅芳 趙小環(huán) 王麗萍 許曉燕 孫高高

從子宮頸癌的早期診斷方法子宮頸脫落細(xì)胞巴氏涂片技術(shù)，到目前廣泛應(yīng)用于臨床的子宮頸液基薄層細(xì)胞技術(shù)（thinprep cytologic test，TCT），都主要是評估子宮頸上皮細(xì)胞核的形態(tài)，其結(jié)果在不同研究中敏感性差異較大（33.8%～94.0%）。因此，有必要開發(fā)更可靠的，包括新型生物標(biāo)志、診斷標(biāo)志物在內(nèi)的替代診斷試驗(yàn)方法[1]。

一、新的子宮頸癌相關(guān)蛋白生物標(biāo)志物和診斷靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)

蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為一種有力的工具，揭示了病毒感染與蛋白質(zhì)變化之間的聯(lián)系。在子宮頸癌相關(guān)細(xì)胞系和組織樣品中已經(jīng)使用了多種基于凝膠的二維凝膠電泳（twodimensional gel electrophoresis，2DE）和無凝膠方法液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatography-massspectrometry，LC-MS）。將蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)與其他“OMICS”數(shù)據(jù)（如基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等）相結(jié)合，已經(jīng)確立了其在系統(tǒng)生物學(xué)的作用[2]。個(gè)性化治療子宮頸癌的藥物可以通過腫瘤的分子鑒定來完成，這將促進(jìn)靶向治療的選擇。目前子宮頸癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究為發(fā)現(xiàn)早期診斷子宮頸癌生物標(biāo)記物提供了良好的方法和靶標(biāo)[3]，并為闡明最終導(dǎo)致子宮頸癌發(fā)生的人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染的分子途徑提供了可靠手段。蛋白質(zhì)組學(xué)被用來研究子宮頸癌基因治療藥物的作用，進(jìn)而在分子水平上解釋其作用模式[4]。

子宮頸癌主要由HPV引起，且HPV16和HPV18為最常見的亞型。HPV顆粒含有一個(gè)由8個(gè)基因組成的8 000 bp的雙鏈閉環(huán)DNA[5-6]。乳頭狀瘤病毒（papillomaviruses，PVs）屬于無包膜的病毒組，可引起良性病變，稱為黏膜上的非生殖器皮膚疣和肛門生殖器疣（尖銳濕疣）。PVs也是導(dǎo)致上皮惡性腫瘤的原因，其可導(dǎo)致子宮頸癌和泌尿生殖道的其他腫瘤。HPV具有感染黏膜如口腔黏膜和子宮頸黏膜的潛能，導(dǎo)致的臨床結(jié)果具有多樣性，由于它們會(huì)被免疫系統(tǒng)清除導(dǎo)致無癥狀、自我限制或惡性轉(zhuǎn)化[7-8]。雖然診斷工具廣泛應(yīng)用，但全世界子宮頸癌發(fā)病率仍然居高不下，特別是在發(fā)展中國家，這主要?dú)w因于TCT敏感性不理想[9-10]。蛋白質(zhì)組學(xué)方法已被用于研究HPV與子宮頸癌病理的相關(guān)性，以及研究早期子宮頸癌診斷和藥物作用模式的假定生物標(biāo)志物?；谛蛄邢嗨菩?，根據(jù)國際病毒分類委員會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)對HPV進(jìn)行分類。根據(jù)從人類組織中分離和鑒定基因組的分類，截至2013年的分類共包括170個(gè)測序的HPV類型。HPV可通過表皮上的輕微磨損而感染子宮頸上皮的基底層，一旦侵入，它會(huì)經(jīng)歷以下幾個(gè)階段。在擴(kuò)增階段，HPV在受感染的細(xì)胞中作為50～100個(gè)拷貝的增殖速度導(dǎo)致低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）。在維持階段，病毒被整合到宿主基因組中并逐漸發(fā)展為高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（high grade squamous intraepithelial lesion，LSIL），甚至子宮頸浸潤癌。最后是復(fù)制或擴(kuò)增階段，HPV在分化細(xì)胞中高拷貝數(shù)的病毒DNA擴(kuò)增導(dǎo)致其在病毒衣殼中的包裝。在子宮頸癌中，病毒DNA的整合導(dǎo)致E6和E7蛋白過度表達(dá)，并伴隨著E1、E2、E4、E5以及L1、L2衣殼蛋白表達(dá)的喪失[11]。

研究者對子宮頸癌蛋白質(zhì)組學(xué)有很大的興趣，主要是由于其可以高效發(fā)現(xiàn)診斷以及預(yù)后生物標(biāo)志物。發(fā)現(xiàn)新型生物標(biāo)記物的第一步主要是利用已建立的體外系統(tǒng)研究差異表達(dá)的蛋白質(zhì)[12]。由于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p16INK4a在異常增生上皮中高表達(dá)，p16INK4a蛋白已被提議用于早期診斷子宮頸癌。p16INK4a和細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67的雙染色細(xì)胞學(xué)可提高診斷的靈敏度[13-15]。然而，由于沒有用于免疫組織化學(xué)和細(xì)胞學(xué)的統(tǒng)一評分系統(tǒng)等局限性妨礙了這些生物標(biāo)志物在子宮頸癌篩查中的聯(lián)合應(yīng)用。在相同的情況下，已經(jīng)提出了一些額外的標(biāo)志物用于子宮頸癌的早期檢測，例如作為E5 HPV蛋白質(zhì)的靶標(biāo)的表皮生長因子受體、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的p21和p27抑制劑、環(huán)氧化酶-2、血管內(nèi)皮生長因子和小窩蛋白-1等。HPV癌蛋白的分子靶點(diǎn)是與HPV癌蛋白（如E5，E6和E7）相互作用的蛋白質(zhì)，主要在癌發(fā)生的早期階段相互作用，并且其可能是潛在的用于臨床的生物標(biāo)志物[16-18]。其他推測的標(biāo)志物是ProEx C免疫細(xì)胞化學(xué)測定靶向拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ蛋白和微染色體維持復(fù)合物Ⅱ蛋白的表達(dá)以及受E5、E6和E7 HPV蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的微小RNA的水平[19-23]。Lin等[24-25]報(bào)道了罕見和高度侵襲性子宮頸癌（神經(jīng)內(nèi)分泌子宮頸癌）的假定診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，聯(lián)合使用二維差異凝膠電泳（two dimension difference gel electrophoresis，2D-DIGE）與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）以期揭示神經(jīng)內(nèi)分泌和非神經(jīng)內(nèi)分泌子宮頸癌之間在蛋白質(zhì)組水平上的差異，從而鑒定潛在的神經(jīng)內(nèi)分泌生物標(biāo)志物。將神經(jīng)內(nèi)分泌起源的子宮頸細(xì)胞癌系HM-1與非神經(jīng)內(nèi)分泌起源的細(xì)胞系CaSki、ME-180和Hela進(jìn)行比較，鑒定發(fā)現(xiàn)了82個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。與非神經(jīng)內(nèi)分泌起源的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)凝蛋白（transgelin）和半乳糖凝集素1（galectin-1）在HM-1細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而stath和磷酸甘油酸激酶1（phosphoglycerate kinase 1，PGK1）表達(dá)下調(diào)，蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)一步驗(yàn)證了transgelin和galectin-1這一發(fā)現(xiàn)[26-30]。

診斷、預(yù)后和預(yù)測性生物標(biāo)志物的評估已應(yīng)用于臨床，目前報(bào)道的多項(xiàng)研究已經(jīng)通過多種蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測了生物樣品的潛在生物標(biāo)志物，如組織、血漿/血清、細(xì)胞活組織檢查 /子宮頸拭子、來自細(xì)胞活組織檢查的殘余液體、細(xì)胞粘液和子宮頸陰道液體（CVF）。在最近的一項(xiàng)研究中，通過2D-DIGE法分析來自正常子宮頸、子宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期）和子宮頸鱗狀細(xì)胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）（Ⅰb和Ⅱa期）的組織樣本，鑒定了26個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。通過蛋白質(zhì)印跡和免疫組化進(jìn)一步驗(yàn)證，S100A9、eEF1A1、丙酮酸激酶2（pyruvate kinase M2，PKM2）被推薦為診斷性生物標(biāo)志物[31]。在另一項(xiàng)研究中，通過激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection，LCM）和2D-DIGE蛋白質(zhì)組學(xué)分析正常子宮頸上皮組織、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）和子宮頸癌組織，鑒定了23個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)[32-35]。從上述定量差異中，通過免疫組化進(jìn)一步分析cornulin、PA28β、熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）B1和MnSOD，發(fā)現(xiàn)cornulin是最重要的假定生物標(biāo)志物。作者對文獻(xiàn)進(jìn)行了批判性回顧，以根據(jù)HPV直接或間接相互作用、潛伏期中的生長選擇或病變微環(huán)境中的相互作用對潛在標(biāo)記物進(jìn)行分類[36-38]。2DE結(jié)合LC-MS/MS被用來鑒定人類CSCC組織和正常組織之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，鑒定出5個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并通過蛋白質(zhì)印跡法在臨床樣品和代表性子宮頸癌細(xì)胞系中進(jìn)一步驗(yàn)證，HSP70、HSP27和轉(zhuǎn)基因蛋白-2表達(dá)上調(diào)。

在一項(xiàng)研究中，其中通過2DE分析CSCC和鱗狀細(xì)胞陰道癌（SVC）的組織蛋白質(zhì)組以及與其對應(yīng)的正常粘膜對照，以鑒定子宮頸癌假定生物標(biāo)志物的組織特異性，比較鑒定了99個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)用于CSCC的特異性區(qū)分[39]。通過2D/MALDI-TOF-MS法將子宮頸癌組織與正常組織進(jìn)行比較，鑒定了30個(gè)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中HSP60在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，并且通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步驗(yàn)證了這一觀察結(jié)果。然而，HSP60 mRNA水平在腫瘤和對照之間沒有顯著差異，表明HSP60的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)參與了子宮頸癌的進(jìn)展，HSP60也被提議作為預(yù)后指標(biāo)[40]。

通過LCM結(jié)合多維色譜和串聯(lián)質(zhì)譜分析子宮頸癌進(jìn)展的代表性組織，對差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量并基于基因本體分析，選擇角蛋白4和角蛋白17用于進(jìn)一步驗(yàn)證。從正常組織向腫瘤階段逐漸發(fā)展的過程中，這些蛋白質(zhì)呈現(xiàn)出的趨勢不同，角蛋白17從正常到LSIL、HSIL再到腫瘤階段中表達(dá)增加，而角蛋白4在這一過程中表達(dá)降低。角蛋白17表達(dá)水平和CSCC患者的Kaplan-Meier生存曲線揭示了角蛋白17高表達(dá)與患者低存活率的強(qiáng)相關(guān)性，增加了該蛋白質(zhì)在評估CSCC預(yù)后上的價(jià)值。此研究進(jìn)一步將蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果與臨床數(shù)據(jù)聯(lián)系起來，為角蛋白17在子宮頸癌中的作用提供了充分的證據(jù)[41]。Wang等[42]考慮盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（pelvic lymph node metastasis，PLNM）對子宮頸癌的治療和預(yù)后有重要意義，通過2D-DIGE/MALDI-TOFMS法將有PLNM與無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（NPLNM）患者的子宮頸組織進(jìn)行比較，鑒定了41個(gè)有差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。與NPLNM組相比，F(xiàn)ABP5、HSPB1和MnSOD在PLNM組中表達(dá)上調(diào)，并通過蛋白質(zhì)印跡和免疫組化進(jìn)行了驗(yàn)證。對上述蛋白質(zhì)的Kaplan-Meier存活圖進(jìn)行分析，結(jié)果表明特定蛋白的高表達(dá)水平與生存率低存在較強(qiáng)相關(guān)性，以此可鑒定可靠的生物標(biāo)志物。Yu等[43]通過2D/MALDI-TOFMS分析人CSCC和鄰近的正常子宮頸組織，報(bào)道了55個(gè)差異表達(dá)的的位點(diǎn)。蛋白激酶C（protein kinaseC，PKC）在腫瘤組中與正常組相比表達(dá)上調(diào)，并且通過蛋白質(zhì)印跡和免疫組化分析驗(yàn)證。通過2DE對感染高危HPV 16或18型的子宮頸癌組織與Hela細(xì)胞系進(jìn)行比較，差異表達(dá)的蛋白質(zhì)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)部分被鑒定（分別為30和28）。根據(jù)替代終點(diǎn)生物標(biāo)記如增殖標(biāo)記、亞細(xì)胞定位的調(diào)控標(biāo)記、細(xì)胞周期和遺傳不穩(wěn)定標(biāo)記，將蛋白進(jìn)一步分類，沒有進(jìn)一步驗(yàn)證上述蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)現(xiàn)。將來自子宮頸上皮的正常組織，而不是源自前皮層的Hela細(xì)胞系，可以更準(zhǔn)確地進(jìn)行含有HPV 16或18型的臨床樣品的比較。由于通過腹部手術(shù)獲得的正常子宮頸組織非常少見，所以子宮頸細(xì)胞系可能是另一種選擇，如HCK1T細(xì)胞[44]。學(xué)者通過2DE分析人類CSCC和其相鄰的正常組織，發(fā)現(xiàn)55個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中Tyk2、S100A9和ZNF217在腫瘤組中的表達(dá)上調(diào)，并且通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步驗(yàn)證，表明其在診斷和治療中可能起作用[45-46]。目前認(rèn)為，在相同情況下，通過2D/ MALDI-TOF-MS將CSCC組織與正常組織進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn) 7種蛋白質(zhì)（AIF-1、ALP2、B-FABP、NCK-1、ICA69、PRSS1和CDK4）在腫瘤組中表達(dá)上調(diào)，并在mRNA水平得到驗(yàn)證。B-FABP、NCK-1和CDK4的差異表達(dá)也經(jīng)蛋白質(zhì)印跡和免疫組化證實(shí)，可作為可能的子宮頸腫瘤標(biāo)志物[47]。在一項(xiàng)類似的研究中，通過2D/MALDI-TOF-MS將CSCC組織與正常組織進(jìn)行比較，鑒定了35個(gè)表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)。14-3-3ε、膜聯(lián)蛋白A1和鱗狀細(xì)胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCCA）-2是最顯著的發(fā)現(xiàn)，后兩個(gè)進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)印跡法得到驗(yàn)證[48-49]。

在對患者血漿/血清的研究中，蛋白組學(xué)同樣有重要發(fā)現(xiàn)。通過2D/MALDI-TOF-MS分析來自對照組、CIN Ⅲ和CSCC Ⅳ期患者的血漿樣品，得到了18個(gè)表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)。細(xì)胞角蛋白19和四連蛋白通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）得到驗(yàn)證。雖然細(xì)胞角蛋白19不是一種真正的分泌蛋白，但它可以在腫瘤中經(jīng)蛋白水解后在血流中釋放[50]。使用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（surface enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）和陽離子交換蛋白芯片分析早期子宮頸癌（原位癌），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的浸潤性子宮頸癌和對照組的血漿樣本，鑒定每個(gè)組的特異性峰模式，從而闡明原位癌和侵襲性癌之間的差異蛋白質(zhì)組譜[51]。然而，沒有確定特征峰限制了該研究。為比較CSCC患者和慢性子宮頸炎患者的血漿的蛋白質(zhì)組，使用了一種替代方法。通過生物反應(yīng)路徑生物信息學(xué)工具鑒定和分析了16個(gè)表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)，由于其與腫瘤的生物學(xué)相關(guān)性，APOA1、APOE、CP、CLU、FBLN1、MASP2、TTR被重點(diǎn)關(guān)注。其中APOA1，APOE和CLU的水平通過ELISA測定，并且發(fā)現(xiàn)與慢性子宮頸炎相比，LSIL、HSIL和子宮頸癌中的水平顯著不同，使其成為可能的血漿生物標(biāo)志物。通過將來自子宮頸癌患者的血清樣品與來自健康供者的血清進(jìn)行比較，得出了3個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的峰值。第1個(gè)是對應(yīng)于纖維蛋白原α-E鏈內(nèi)部片段的5 906 Da的上調(diào)蛋白質(zhì)，另2個(gè)4 175、3 974 Da的峰被認(rèn)為是可能的生物標(biāo)志物，但無法確定[52]。另一項(xiàng)研究中，通過2D-DIGE/LC-MS分析對照，CIN Ⅲ患者、CSCC早期（CSCCⅠ和Ⅱ）和CSCC晚期（CSCC Ⅲ和Ⅳ）患者的血清樣品，在152份樣本中通過ELISA驗(yàn)證補(bǔ)體因子H、CD5樣抗原、凝溶膠蛋白和銅藍(lán)蛋白，并將20個(gè)表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)摻入生物網(wǎng)絡(luò)中，其中凝溶膠蛋白和血漿銅藍(lán)蛋白與癌基因核因子（nuclear factor，NF）κB相互作用。通過免疫組化檢測上述蛋白質(zhì)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在微浸潤和癌變病灶中的染色強(qiáng)度較高，表明它們是LSIL進(jìn)展為子宮頸癌的預(yù)測性生物標(biāo)志物[53]。使用超靈敏的高性能LC-激光誘導(dǎo)的基于熒光的蛋白質(zhì)組學(xué)方法來分析從子宮頸癌患者和健康對照組的脫落細(xì)胞樣本及血清的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。通過數(shù)據(jù)分析區(qū)分每種情況下的蛋白質(zhì)組峰分布，對腫瘤、癌前期和健康階段準(zhǔn)確分類，使得該方法成為可能的診斷工具。即使沒有確定峰，作者聲稱蛋白質(zhì)譜可視化在早期鑒別正常組織與惡性腫瘤階段組織是有效的[54]。另一組使用相對和絕對定量的等壓標(biāo)簽（iTRAQ）和靶向質(zhì)譜定量聯(lián)合分析來自CIN、早期（CES）和晚期（CLS）子宮頸癌患者的血清，分析鑒定了6種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)（α-1-酸性糖蛋白1、α-1-抗胰蛋白酶、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白、α-2-HS-糖蛋白和維生素D結(jié)合蛋白）。在由對照組、CLS和卵巢癌組成的獨(dú)立組的229個(gè)血清樣本中通過多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）驗(yàn)證了6個(gè)可以從健康對照中區(qū)分CIN患者的蛋白質(zhì)組，靈敏度為67%，特異性為88%。與SCCA（一種被廣泛研究的假定的子宮頸癌生物標(biāo)記物）的特異性結(jié)合，改善了對健康對照組的CIN、CES和CLS患者的區(qū)分。受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析顯示，僅使用SSCA時(shí)、使用6個(gè)蛋白質(zhì)組時(shí)以及兩種方法聯(lián)合使用時(shí)進(jìn)行CIN與健康組的比較，發(fā)現(xiàn)曲線下面積（area under curve，AUC）依次遞增。作者指出，到目前為止，任何基于血液的診斷測試尚未達(dá)到以上的鑒別水平。在分別使用SSCA或6個(gè)蛋白質(zhì)組進(jìn)行CES與健康組之間的鑒別中，AUC=0.72，而在聯(lián)合使用6個(gè)蛋白質(zhì)組和SCCA進(jìn)行同一鑒別時(shí)，AUC提高到0.86，該研究實(shí)現(xiàn)了臨床上CIN、CES或CLS與對照組的有效區(qū)分[55]。

研究者也對子宮頸活檢和子宮頸拭子來源的臨床標(biāo)本進(jìn)行了蛋白組學(xué)分析。使用來自子宮頸拭子的臨床樣本比較基因組和蛋白質(zhì)水平上的不同分布。特別地將拭子置于稱為RNAlater的含水RNA保存劑中，其在溶解細(xì)胞粘液后允許蛋白質(zhì)沉淀。腫瘤組與正常對照相比，通過2D-DIGE/ MALDI-TOF-MS鑒定了390個(gè)差異表達(dá)的位點(diǎn)。將cDNA微陣列數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合。HNRPA2B1在子宮頸拭子中通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行驗(yàn)證，被認(rèn)為是子宮頸癌的候選生物標(biāo)志物[56]。

新近的研究也報(bào)道了CVF和子宮頸活檢殘留液體的蛋白組學(xué)研究成果。CVF是一種容易獲得的液體，含有豐富的假定生物標(biāo)志物，可用于基于自我檢測的診斷。收集來自健康和CIN的CVF臨床樣本，并使用MALDI-TOF-MS聯(lián)合高效液相色譜技術(shù)（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。兩組之間鑒定出12個(gè)表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)。選擇α-actinin-4用于CVF中的ELISA進(jìn)一步驗(yàn)證，顯示從正常向低危型HPV陽性樣本和高危型HPV陽性樣本的進(jìn)展中，表達(dá)進(jìn)一步增高。更有意思的是，在9例患者的縱向樣品中也進(jìn)行了ELISA檢測，證實(shí)α-actinin-4是判斷健康和癌前病變階段的假定生物標(biāo)記物[57-58]。Boylan等[59]使用另一種方法來研究巴氏涂片臨床樣本的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)正常的Pap測試核心蛋白質(zhì)組和CVF核心蛋白質(zhì)組之間存在高度重疊。通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究細(xì)胞粘液，以期描述子宮頸癌早期診斷生物標(biāo)志物的總蛋白質(zhì)組。通過2DE-MS和基于凝膠的LC-MS/MS技術(shù)相結(jié)合的方法對子宮頸粘液蛋白質(zhì)組進(jìn)行了特征分析。當(dāng)高含量蛋白質(zhì)如白蛋白耗盡后，用2DE-MS分析細(xì)胞粘液。3種方法的結(jié)合產(chǎn)生了107 種獨(dú)特的蛋白質(zhì)，其中大多數(shù)涉及新陳代謝，免疫應(yīng)答和轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，通過熒光染料檢測了糖基化和磷酸化的翻譯后修飾（post translational modif i cation，PTM），發(fā)現(xiàn)急性期血漿蛋白、α-1-抗胰凝乳蛋白酶和α-1-抗胰蛋白酶等分子被磷酸化和糖基化[60]。而在一組獨(dú)立樣本中未嘗試驗(yàn)證初始結(jié)果，并且差異表達(dá)的峰未被鑒定。因此，將來需要分析更多的樣本并進(jìn)行與臨床階段的相關(guān)性（Kaplan-Meier/ ROC曲線）分析，以獲得可用于早期子宮頸癌診斷的結(jié)果。

二、治療子宮頸癌的藥物作用、治療靶標(biāo)和作用機(jī)制的評估

（一）治療子宮頸癌的藥物作用

體外系統(tǒng)在評估治療子宮頸癌的藥物效應(yīng)中已廣泛應(yīng)用，一般通過測試不同的藥物和許多有希望實(shí)現(xiàn)化療作用的化合物開發(fā)新型藥物。順鉑是一種廣泛使用的化療藥物，其可以破壞DNA，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。與放射治療聯(lián)合使用，可有效治療子宮頸癌。為了闡明順鉑的抗增殖機(jī)制，使用處理和未處理的Hela細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究[61-62]。作者應(yīng)用基于2DE的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，揭示了兩組之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，如順鉑治療組中I-TRAF和p27Kip的表達(dá)上調(diào)，而c-myc和PCNA表達(dá)下調(diào)。通過蛋白質(zhì)印跡結(jié)果提示順鉑可能影響細(xì)胞凋亡途徑，如眾所周知的膜死亡受體（eath receptor，DR）介導(dǎo)的和線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑[61-62]。

治療子宮頸癌的另一種常用藥物是5-氟尿嘧啶（5-f l uorouracil，5-FU），它是一種嘧啶類似物，可使細(xì)胞周期停滯于S期。在Hela細(xì)胞系（HPV18陽性）中通過2DE評價(jià)了5-FU和順鉑對子宮頸癌治療的協(xié)同效應(yīng)。蛋白質(zhì)印跡分析所示，在用兩種藥物處理的組中觀察到凋亡的下游靶標(biāo)的表達(dá)最高，鑒定出不同組間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)（I-TRAF、CIDE-B、c-myc和 SCCA-2）。I-TRAF和 CIDE-B在5-FU和聯(lián)合處理的Hela細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而c-myc和SCCA-2在5-FU和聯(lián)合處理的Hela細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。這項(xiàng)研究闡明了上述藥物聯(lián)合作用的影響，并提示這些藥物可以激活膜DR介導(dǎo)的和線粒體介導(dǎo)的凋亡通路[63]。

Yim等[64]研究了另一種藥物紫杉醇的作用，通過比較紫杉醇處理的Hela細(xì)胞和相應(yīng)未處理的細(xì)胞組，發(fā)現(xiàn)caspase-5和caspase-8在紫杉醇處理組中表達(dá)上調(diào)，而bcl-2和c-myc的表達(dá)下調(diào)，說明這種藥物通過DR介導(dǎo)的和細(xì)胞色素c依賴性途徑參與細(xì)胞凋亡。在同一組的以下研究中，上述蛋白質(zhì)組學(xué)方法也用于闡明紫杉醇對細(xì)胞周期停滯的作用。通過MTT分析Hela、CaSki（HPV16+）和C33A（HPV-）細(xì)胞系中的細(xì)胞毒性效應(yīng)，將紫杉醇處理的細(xì)胞與未處理的對照進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了與凋亡相關(guān)的差異表達(dá)的蛋白TRAIL、caspase-5、caspase-8、bcl-2，并且通過蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證。阻滯細(xì)胞周期的有絲分裂蛋白BUB3也在紫杉醇處理組中上調(diào)，因?yàn)橛薪z分裂G2/M被繞過，BUB3的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）敲除導(dǎo)致細(xì)胞周期失調(diào)[65]。

在相關(guān)研究中，不同藥物的作用主要通過對Hela細(xì)胞進(jìn)行評估。Hela細(xì)胞是侵襲性腺癌的代表，并且是HPV18陽性的。對幾種子宮頸癌細(xì)胞系的批判性評估認(rèn)為，Hela細(xì)胞是一種合適的分析藥物細(xì)胞毒性模型[66-67]。對通常使用的抗癌藥物（如順鉑，5-FU，紫杉醇）以及其他天然化合物進(jìn)行體外測試，研究其細(xì)胞毒性和抗子宮頸癌細(xì)胞的作用方式。它們中的大多數(shù)通過膜DR和線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。此外，這些藥物可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和氧化應(yīng)激。這些初步結(jié)果需要通過高靈敏度LC-MS/MS進(jìn)一步分析，以詳細(xì)闡明每種藥物的作用機(jī)制。此外，研究顯示所選抗癌藥物可能對翻譯過程起作用，使蛋白質(zhì)組學(xué)成為上述闡明藥物表達(dá)機(jī)理的有力工具。

（二）子宮頸癌的治療靶標(biāo)及作用機(jī)制

目前，盡管有廣泛應(yīng)用于診斷的TCT以及適用于導(dǎo)致該病（HPV16和HPV18）最常見HPV類型的疫苗，子宮頸癌發(fā)病率仍然居高不下，尤其是在第三世界國家。這主要是由于缺乏基本的篩查和治療手段。在這種情況下，有必要闡明與子宮頸癌相關(guān)的HPV的分子途徑以及靶向子宮頸癌腫瘤藥物的分子機(jī)制。此外，迫切需要能夠在最早階段檢測子宮頸癌的新型生物標(biāo)志物。蛋白質(zhì)組學(xué)可以分析與惡性腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)變化或藥物治療，進(jìn)而促進(jìn)實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)。體外模型是評估的第一步，因?yàn)樗鼈兺ǔ４矸€(wěn)定的系統(tǒng)，易于處理，并且沒有臨床樣本中觀察到的變異性。用于不同HPV類型的代表性子宮頸癌細(xì)胞系可用于研究藥物治療或子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的蛋白質(zhì)組學(xué)變化。相較之下，體外系統(tǒng)存在一定的限制，如高濃度的蛋白質(zhì)可能會(huì)掩蓋其他濃度較低的蛋白質(zhì)，而這些蛋白質(zhì)往往是我們所感興趣的。

關(guān)于分泌的研究還沒有報(bào)道。然而，分泌的分子參與細(xì)胞間通訊，并且可以促成腫瘤的特定標(biāo)志。對他們的分析具有挑戰(zhàn)性，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中使用臨床樣品的局限性在于其高度復(fù)雜性和不斷增加的變異性，另一個(gè)限制是用于驗(yàn)證臨床樣品的可用性，特別是免疫組化所需的組織樣品。大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)有限樣本量以及大量的蛋白質(zhì)檢測可能會(huì)導(dǎo)致一些假陽性?？紤]到臨床樣本的數(shù)量和質(zhì)量，設(shè)計(jì)多個(gè)重要因素，可以改善這個(gè)問題。在數(shù)據(jù)分析過程中應(yīng)用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，包括調(diào)整多重檢測，可在臨床樣本上理想地區(qū)分假陽性和真陽性以確定臨床相關(guān)性。因此，為了增加結(jié)果的有效性，應(yīng)使用多種方法（如蛋白質(zhì)印跡、免疫組化、MRM）對蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的后續(xù)驗(yàn)證。迄今為止，SELDI-TOF-MS可以區(qū)分正常組和病理組之間的蛋白質(zhì)模式，但其主要缺點(diǎn)是無法鑒定特定蛋白質(zhì)[68-69]。與2DE-MALDI-TOF-MS是過去廣泛使用的方法，但是該領(lǐng)域正在向能夠全面表征蛋白質(zhì)組的更具體和更靈敏的方法（主要是基于LC-MS/MS的方法）迅速發(fā)展[70-71]。在子宮頸癌蛋白質(zhì)組學(xué)方面，大多數(shù)已發(fā)表的研究都是基于2DE-MALDI-TOF-MS的，但最近一些使用高靈敏度LC-MS/MS方法的報(bào)道顯著改善了宮頸癌蛋白質(zhì)組的表征[72-73]。蛋白質(zhì)組學(xué)方法將有助于更好地了解抗癌藥物的作用機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物。

也許，未來的蛋白質(zhì)組學(xué)研究將能夠進(jìn)一步評估導(dǎo)致子宮頸癌的HPV生物學(xué)及其相關(guān)現(xiàn)象。LC-MS/MS的應(yīng)用和準(zhǔn)確的定量（iTRAQ、ICAT或labelfree）方法可以增加對現(xiàn)有子宮頸癌的認(rèn)識，但LC-MS/MS尚未被廣泛使用[74-76]。新一代的MS儀器將能夠識別低濃度蛋白質(zhì)，并研究與子宮頸癌發(fā)展、診斷和治療相關(guān)的具體PTM。PTM參與了細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞間相互作用，在子宮頸癌中具有關(guān)鍵作用[77-79]。PTM將在未來廣泛研究，主要研究目的是將特定的修飾與疾病進(jìn)展及結(jié)局聯(lián)系起來，而不僅是蛋白質(zhì)表達(dá)改變。系統(tǒng)生物學(xué)結(jié)合現(xiàn)有“OMICS”方法的新興手段有助于疾病理解和評估高通量技術(shù)產(chǎn)生的豐富信息[80-82]。

三、子宮頸癌相關(guān)微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作為診斷和治療靶標(biāo)的篩選

miRNA是含20～23個(gè)核苷酸的小分子RNA，不編碼蛋白質(zhì)，與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和腫瘤的致病機(jī)制有關(guān)，在診斷和治療中具有重要作用[83-84]。目前已證實(shí)的與子宮頸癌有關(guān)的miRNA有miR-21、miR-126和miR-143，這些miRNAs用于診斷和治療子宮頸癌的臨床應(yīng)用正在進(jìn)一步研究中。子宮頸癌的診斷方法包括分析血清中特異性miRNA水平的變化和miRNA異常高甲基化的測定。miRNA通過基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控參與腫瘤發(fā)病機(jī)制[85-86]。miRNA作為腫瘤診斷標(biāo)志物和抗癌治療的使用已經(jīng)有許多研究。參與腫瘤發(fā)生的miRNA分為致癌miRNA和抑癌miRNA[87-88]。miRNA通過結(jié)合到靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）中的互補(bǔ)序列上，抑制靶mRNA翻譯并增加降解從而導(dǎo)致基因表達(dá)的下調(diào)。miRNA抑制靶基因翻譯的機(jī)制導(dǎo)致真核生物啟動(dòng)子作用被阻斷。包含1個(gè)miRNA的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體結(jié)合到mRNA的3'-UTR，誘發(fā)CCR4-CAF1-NOT mRNA復(fù)合體形成多聚A尾截?cái)啵瑢?dǎo)致下游多聚腺苷酸尾的斷裂，減少翻譯起始因子的結(jié)合并抑制翻譯[89]。

最近的研究表明，miRNA誘導(dǎo)的異常調(diào)節(jié)機(jī)制參與多種疾病的發(fā)病機(jī)制，包括惡性腫瘤，miRNA表達(dá)水平在人類腫瘤組織中降低[90-91]。因此，許多miRNA可能具有抑制腫瘤的潛力，包括與p53基因相關(guān)的miRNA[92-93]。Georges等[94]和Braun等[95]分別發(fā)現(xiàn)miR-192、miR-194和miR-215以p53依賴的方式被DNA損傷所誘導(dǎo)，而Yan等將miR-17、miR-92簇鑒定為在缺氧條件下由p53抑制的miRNA。在篩選調(diào)控p53通路的miRNA時(shí)，發(fā)現(xiàn)miR-29家族（miR-29a、miR-29b和miR-29c）激活p53通路[96-97]。此外，miR-122通過細(xì)胞周期蛋白G1正向調(diào)節(jié)p53通路，miR-125b直接抑制p53，miR-21通過靶向非均一核糖核蛋白K（HNPRK，p53通路正向調(diào)控因子）和p53同系物p63負(fù)調(diào)節(jié)p53通路。基于miR-372和miR-373通過LATS2抑制p53誘導(dǎo)的CDK的負(fù)調(diào)控，miRNA還可以影響下游p53通路[96-100]。

有許多抑癌miRNA的報(bào)道，如miR-138參與端粒酶的調(diào)節(jié)。端粒酶是一種通過在染色體末端延伸端粒而與細(xì)胞永生化和癌發(fā)生強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)的酶，其活性取決于人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)。MiR-138通過抑制人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA水平來降低端粒酶活性。MiR-138在子宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于正常組織，從而引起端粒酶活化和癌變。在Hela和C33-A宮頸癌細(xì)胞中，過度表達(dá)的miR-7抑制細(xì)胞生長并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而抑制miR-7表達(dá)具有相反的作用。因此，miR-7是一種抑癌miRNA[101-103]。miR-17-5p靶向腫瘤蛋白p53可誘導(dǎo)核蛋白1（tumor protein p53-induced nuclear protein 1，TP53INP1）并抑制細(xì)胞生長，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。TP53INP1在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，如果TP53INP1異位表達(dá)，干擾miR-17-5p誘導(dǎo)的細(xì)胞生長收到抑制。在子宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)了TP53INP1和miR-17-5p之間的類似關(guān)系。因此，miR-17-5p也可能是腫瘤抑制因子miRNA。有研究者通過MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分析子宮頸癌細(xì)胞中的細(xì)胞生長和細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示通過靶向PI3K /Akt / mTOR信號通路miR-125b過表達(dá)，從而抑制磷酸肌醇3-激酶催化亞基δ（PIK3CD），進(jìn)而抑制細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤發(fā)生[104-107]。

由于核糖核酸酶的存在，RNA進(jìn)入血液后被迅速降解。因此，最初認(rèn)為miRNA不存在于血清中，并且細(xì)胞中的miRNA通常用于miRNA表達(dá)分析[108-109]。然而，2007年發(fā)現(xiàn)分泌的miRNA被包含在外泌體和在血液中循環(huán)的顆粒狀囊泡中，隨后發(fā)現(xiàn)這些miRNA通過細(xì)胞間通訊、經(jīng)由胎盤和母乳轉(zhuǎn)移的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用[110-111]。細(xì)胞外分泌的miRNA在腫瘤診斷和治療中也是有意義的，因?yàn)槟[瘤患者的分泌miRNA譜與正常志愿者的miRNA分布顯著不同。在腫瘤中具有特異性表達(dá)變化的miRNA具有基于血漿和血清測試的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力[112-114]。MiR-126和miR-21存在于血清中并與子宮頸癌相關(guān)。在從子宮頸癌患者收集的血清中發(fā)現(xiàn)了其他新的候選miRNA標(biāo)記物。檢測發(fā)現(xiàn) miR-21、miR-27a、miR-34a、miR-146a、miR-155、miR-196a、miR-203、miR-34在CSCC中高表達(dá)。這些結(jié)果表明，血清中的miRNA水平可用于自宮頸癌的診斷，并且一些miRNA可用于預(yù)測組織類型和用于子宮頸癌的早期診斷[115-122]。

有趣的是，血清中的幾種miRNA已被確定為子宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的候選標(biāo)記物。分析了宮頸癌臨床（FIGO）分期Ⅰ至ⅡA期的子宮頸癌患者中治療前收集的血清中miR-20a和miR-203的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)子宮頸癌患者血清中miR-20a水平顯著高于健康者，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中表達(dá)更高。子宮頸癌患者miR-203的表達(dá)水平與健康志愿者相比有升高的趨勢，然而只有當(dāng)miR-203表達(dá)被抑制時(shí)才發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。分析有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，血清miR-20a的AUC高于miR-203的AUC，說明miR-203是比miR-20a低的標(biāo)記。Zhao等[123-125]研究顯示miR-20a的過表達(dá)與組織學(xué)分級和腫瘤大小有關(guān)。Chen等[126-129]進(jìn)行了一項(xiàng)對早期子宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的miRNA標(biāo)記物研究，通過qPCR測量miRNA表達(dá)水平并確定ROC曲線，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的候選標(biāo)記物是miR-1246、miR-20a、miR-2392、miR-3147、miR-3162-5p和 miR-4484，并且發(fā)現(xiàn)血清中的miRNA比血清中的SCC抗原更能預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Huang等[130-134]對子宮頸小細(xì)胞癌（small cell carcinoma of the cervix，SCCC）患者進(jìn)行了miRNA研究，發(fā)現(xiàn)相對于早期SCCC患者（FIGO2008分期IB1），在晚期SCCC患者（FIGO 2008 IB2-IV）中7種miRNA（let-7c、miR-10b、miR-100、miR-125b、miR-143、miR-145和 miR-199a-5p）的表達(dá)水平顯著下降。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中，let-7c、miR-100、miR-125b、miR-143、miR-145和 miR-199a-5p的表達(dá)被抑制。Kaplan-Meier生存曲線顯示，低表達(dá)miR-100和miR-125b的患者預(yù)后較差。這些結(jié)果提示，篩選miRNA可以有效鑒別早期子宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)測晚期患者的預(yù)后。

目前認(rèn)為，可通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)水平進(jìn)行抗腫瘤治療。包括通過使用互補(bǔ)核酸序列或通過降低實(shí)際表達(dá)水平來抑制在腫瘤中過表達(dá)的miRNA功能，也可通過補(bǔ)充miRNA來恢復(fù)在腫瘤中水平降低的miRNA功能。這兩種策略都使用合成的基于核酸的藥物。MiRNA潛在的臨床應(yīng)用越來越被認(rèn)可，血清中分泌的miRNA可用于腫瘤診斷（包括基于各種miRNA血清水平的變化對子宮頸癌的早期診斷），通過MSP和COBRA檢查miRNA基因的異常甲基化在子宮頸癌中是有效的，并且通過對各種miRNA的組合分析可以提高診斷和分期確定的準(zhǔn)確性[135-137]。傳統(tǒng)siRNA藥物開發(fā)的知識，應(yīng)用于治療子宮頸癌也變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。在子宮頸癌中miR-21的抑制劑已經(jīng)被開發(fā)出來，并且目前正在使用新技術(shù)來研究該miRNA的抑制。相反，miR-143在子宮頸癌中下調(diào)，并且在小鼠中移植人骨肉瘤細(xì)胞后通過補(bǔ)充miR-143實(shí)現(xiàn)了抗癌效果。因此，未來miRNA補(bǔ)充療法將成為治療子宮頸癌的新技術(shù)。這些發(fā)現(xiàn)提示miRNA特異性個(gè)體化治療和分子靶向治療的許多方法，并且miRNA可能在子宮頸癌的診斷和治療中起重要作用。

本文回顧了近年來關(guān)于子宮頸癌細(xì)胞相關(guān)蛋白生物學(xué)標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及其評估技術(shù)的更新，從早期的巴氏涂片技術(shù)到現(xiàn)在的TCT以及HPV檢測技術(shù)，診斷、預(yù)后和預(yù)測性生物標(biāo)志物的評估也在臨床水平上進(jìn)行，蛋白質(zhì)組學(xué)方法已被廣泛應(yīng)用，進(jìn)而可開發(fā)有效的診斷標(biāo)志物，包括蛋白、miRNA在內(nèi)的子宮頸癌的新型標(biāo)志物被大量鑒定，并逐步應(yīng)用于臨床。但仍需要高質(zhì)量的研究發(fā)現(xiàn)具有良好敏感性和特異性的子宮頸癌新型生物學(xué)標(biāo)志物、診斷及治療靶標(biāo)。