錢道海 宋國棟 張洲 馬志龍 王冠男 于文建 陳鵬 王小明

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是臨床危重病之一，迄今尚無有效治療方法，其總體死亡率高達13%～35%[1]，嚴(yán)重危及患者的生命。

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新、多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)以及低免疫原性的成體干細胞[2-3]，目前已成功用于一些頑固性疾病的治療，如自身免疫性紅斑狼瘡[4]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[5]等，挽救了很多患者的生命。近期研究發(fā)現(xiàn)，骨髓來源的間充質(zhì)干細胞（bone marrowderived mesenchymal stem cells，BMSCs）具有修復(fù)SAP潛能，有望用于臨床，但具體機理尚不完全清楚[6-8]。

傳統(tǒng)上，細胞死亡分為凋亡和壞死兩類。而近年研究表明，壞死性凋亡（Necroptosis）不同于壞死和凋亡，是一種新型細胞死亡途徑，受到細胞信號通路的調(diào)控，是一種可調(diào)控性的細胞壞死，并在多種疾病模型中發(fā)揮著重要作用[9-10]。因此，本研究觀察壞死性凋亡在SAP中作用，以及BMSCs修復(fù)SAP可能機理，為揭示SAP發(fā)病機理以及BMSCs的治療機制奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料、試劑及儀器

1.實驗動物：雄性SD大鼠購于上海斯萊克動物中心，4～6周齡（100～120 g）和6～8周齡（200～240 g）的大鼠分別用于干細胞提取和SAP模型的制備。所有動物實驗得到皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2.試劑及儀器：淀粉酶檢測試劑盒（美國BioVision公司），RIPA裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、HE染色試劑盒（中國碧云天生物科技有限公司），青霉素、鏈霉素、TRIzol（美國Invitrogen公司），RIPK1、RIPK3、MLKL、Capase-8抗體（美國CST公司），GAPDH抗體（中國Proteintech公司），CD44、CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34和CD45流式抗體（美國BD公司），牛磺膽酸鈉、硝酸纖維膜、DMSO、二抗（美國Sigma公司），PMSF、DMEM培養(yǎng)液、胰酶、小牛血清（美國Gibico公司），引物合成于華大基因，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒（日本Takara公司），酶標(biāo)儀（美國BioTek公司），高速離心機（德國Eppendorf公司），細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），流式細胞儀（美國BD公司），石蠟切片機（德國Leica公司）。

二、研究方法

1.BMSCs分離、培養(yǎng)和鑒定：收集無菌條件下 4～6周齡 100～150 g SD 大鼠脛骨和股骨，用1×PBS緩沖液沖出骨髓，充分吹打成單細胞懸液，200 μm篩網(wǎng)過濾。在一無菌離心管中，加入0.3 ml Percoll液和 0.7 ml PBS，配成 1.073 g/ml的 Percoll分離液分離骨髓細胞懸液，將收集的細胞懸液緩慢加在分離液上部，300×g離心30 min，去除上清，收集界面層。調(diào)整細胞密度，按1×106個/L密度接種于37 ℃、5 %CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。72 h后更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁細胞，此后每3天換液1次共10 d，待MSCs接近長滿瓶底時，以0.25%胰蛋白酶消化、吹打成單細胞懸液，100×g離心10 min，棄上清，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM低糖培養(yǎng)基懸浮沉淀，按1 : 3比例傳代。取P5細胞進行鑒定，利用成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基分別進行誘導(dǎo)分化，再分別用油紅O、茜素紅S和甲苯胺藍染色進行鑒定。流式細胞分析儀檢測培養(yǎng)細胞表面標(biāo)志物的表達情況，所用抗體包括CD44、CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34和 CD45，同型對照抗體作為對照。

2.大鼠SAP模型和分組：術(shù)前禁食12 h，禁飲4 h。用3%戊巴比妥鈉（0.2 ml/100 g）經(jīng)腹腔內(nèi)注射，待麻醉成功后將大鼠固定于手術(shù)臺上，剪去腹部毛發(fā)，取正中切口逐層進腹，打開腹腔，找到十二指腸乳頭，即膽總管和胰管匯入十二指腸的位置，膽總管近端行微創(chuàng)血管夾夾閉，遠端9-0 prolene縫合一針，松結(jié)固定，從十二指腸乳頭向膽總管近端方向進針，待細針進入膽總管后，行膽總管遠端結(jié)扎，自動微量泵緩緩?fù)谱?%?；悄懰徕c（1 mg/kg），依次松開微創(chuàng)血管夾和prolene線，并縫合十二指腸進針點，清點器械，逐層關(guān)腹；造模成功后24 h經(jīng)尾靜脈注射PBS或者BMSCs（1×107個/kg），因此分成正常組（NC）、假手術(shù)組（Sham）、SAP模型組（SAP）、PBS治療組（PBS）和BMSCs治療組（BMSCs）、Necrostatin-1（Nec-1）治療組、Nec-1對照組。

3.蛋白印跡實驗（Western Blot）：（1）提取蛋白：冰凍組織在低溫下研磨成粉末，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，800×g離心15 min，收集上清液；（2）蛋白定量：將上述蛋白上清液進行BCA法定量；（3）電泳：配置10%的SDS凝膠、蛋白電泳液，將蛋白上清液加入5×loading buffer稀釋，然后置于100℃煮沸10 min，將等量的蛋白質(zhì)加入凝膠孔道中，加入適量的電泳液，插上電源進行蛋白電泳：80 v，15 min，后調(diào)節(jié)到 120 v，100 min；（4）轉(zhuǎn)膜：配置轉(zhuǎn)膜液，待蛋白電泳結(jié)束后，切膠，將NC膜放置于凝膠上方，加入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液，打開電源進行轉(zhuǎn)膜：200 mA，70 min；（5）封閉、孵一抗過夜：將 NC膜放置于含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h，然后放于濕盒中孵育一抗，4℃過夜；（6）孵育二抗：將NC膜放于洗膜液中，洗3次，每次10 min，然后孵育熒光二抗：37℃避光孵育30 min；（7）掃膜：將NC膜避光洗滌3次，每次10 min，然后將NC膜置于掃膜儀中進行掃膜，掃膜結(jié)束后導(dǎo)出圖片，測定灰度值，進行對比分析。

4.胰腺組織RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA檢測

取液氮冰凍的胰腺組織，融化后采用Trizol（Invitrogen公司）提取組織總RNA。先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再行PCR擴增，以GAPDH為內(nèi)參。引物由上海生工生物有限公司合成，序列參見表1，按照實時熒光定量試劑盒（Takara公司）說明書所示，然后上機檢測（Applied Biosystems PCR儀），最后分析，以mRNA相對表達量計算。

表1 目的基因引物序列

5.淀粉酶測定：按照淀粉酶試劑盒說明書進行測定。

6.蘇木精-伊紅染色（HE染色）和胰腺病理評分：（1）取材和固定：從SD大鼠切取新鮮的胰腺組織塊放入4%多聚甲醛中，固定24 h；（2）脫水、透明：自來水沖洗30 min，雙蒸水浸泡5 min，50%乙醇浸泡5 min，70%乙醇浸洗5 min，80%乙醇浸洗5 min，95%乙醇浸洗5 min，無水乙醇浸洗5 min，二甲苯Ⅰ脫蠟5 min，二甲苯Ⅱ脫蠟5 min；（3）浸蠟、包埋：將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫。待石蠟完全浸入組織塊后進行包埋：先制備好容器（如折疊一小紙盒），倒入已溶化的石蠟，迅速夾取已浸透石蠟的組織塊放入其中。冷卻凝固成塊即成。包埋好的組織塊變硬，才能在切片機上切成很薄的切片。（4）切片、撈片：將包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成薄片，一般為5～8 μm厚。切下的薄片放到加熱的水中燙平，再撈到載玻片上，放45 ℃恒溫箱中烘干。（5）脫蠟、HE染色：二甲苯Ⅰ脫蠟5 min，二甲苯Ⅱ脫蠟5 min，無水乙醇浸洗5 min，95%乙醇浸洗5 min，80%乙醇浸洗5 min，70%乙醇浸洗5 min，50%乙醇浸泡5 min，自來水沖洗5 min，雙蒸水浸泡5 min。再進行蘇木精-伊紅染色，將細胞質(zhì)染成紅色或淡紅色，細胞核染成藍色。（6）脫水、透明：染色后的切片經(jīng)純酒精脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明。（7）固定：將已透明的切片滴上中性樹膠，蓋上蓋玻片封固。根據(jù)胰腺組織的水腫（0～4）、炎性細胞浸潤（0～4）、空泡化（0～4）和壞死（0～4）進行病理評分，總分16 分[6-8]。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，胰腺病理評分、淀粉酶水平、基因表達采用表示，各組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、BMSCs分離、培養(yǎng)和鑒定。

BMSCs是一群呈梭形、旋渦樣生長的成纖維樣細胞，P5前細胞形態(tài)基本一致，同時細胞具有很強的分化能力，可分化成脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞（圖1）。流式細胞儀顯示細胞高表達CD44、CD73、CD90和 CD105，表達率分別為 99.82%、99.87%、99.99%、99.78%，低表達 CD11b、CD19、CD34和 CD45，表達率分別為 0.65%，0.85%，0.70%和1.20%（圖2）。

二、BMSCs和Nec-1均可以改善SAP

SAP時，胰腺組織水腫、滲出和壞死顯著（圖3），胰腺淀粉酶水平升高（表2）。BMSCs移植或者Nec-1注射后均能夠減輕SAP后胰腺組織水腫、滲出和壞死（圖3），同時降低血淀粉酶水平（表3）。

表2 各組血清淀粉酶水平測定（±s）

表2 各組血清淀粉酶水平測定（±s）

注：與Sham 組比較，aP＜0.001；與PBS 組相比，bP＜0.001

分組 例數(shù) 胰腺病理評分 淀粉酶（mU/ml）NC 組 6 0.40±0.52 236.62±33.21 Sham 組 6 0.50±0.53 242.31±27.94 SAP 組 6 12.90±1.79a 1052.40±183.10a PBS組 6 12.60±1.65 972.77±204.29 BMSCs組 6 7.20±1.23b 452.21±101.68b Nec-1治療組 6 7.00±1.05b 570.18±148.47b F值 200.275 143.245 P 值 ＜0.001 ＜0.001

三、BMSCs和Nec-1抑制壞死性凋亡

Western Blot和PCR結(jié)果均顯示：與Sham組相比，SAP組受損胰腺組織內(nèi)受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting serine/threonine protein kinase 1，RIPK1）、RIPK3、混合性譜系激酶（mixed lineage kinase domain-like，MLKL）蛋白及 mRNA表達升高，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（cysteine aspartic acid protease-8，Caspase-8）表達下降（圖4，表3）；與PBS組比較，BMSCs移植或者Nec-1注射后，受損的胰腺組織內(nèi)RIPK1、RIPK3、MLKL表達下降，而Caspase-8表達升高（圖4，表3）。

圖1 倒置顯微鏡下觀察BMSCs形態(tài)

圖2 流式細胞分析結(jié)果

圖3 倒置顯微鏡下觀察胰腺組織HE染色切片（×200）

討 論

SAP是臨床急危重病之一，其發(fā)病機制尚不完全清楚[1]。目前得到公認的是胰酶自身消化、白細胞過度激活、級聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)“三大學(xué)說”[12]。此外，氧自由基、鈣超載和線粒體損傷等也參與SAP的發(fā)病過程[12]。最近發(fā)現(xiàn)，壞死性凋亡，一種新的細胞壞死方式，參與多種疾病的發(fā)病過程，亦可能是SAP發(fā)生發(fā)展的主要原因之一[13]。其中RIPK1是壞死性凋亡的主要誘導(dǎo)因子之一。它的C末端為死亡結(jié)構(gòu)域，能夠與死亡受體家族成員Fas、腫瘤壞死因子受體1（TNF receptor 1，TNFR1）、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體1（TNF related apoptosis inducing ligand receptor 1，TRAILR1）、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體2（TNF related apoptosis inducing ligand receptor 2，TRAILR2）等相互作用，啟動下游信號通路，誘導(dǎo)細胞凋亡，而其N末端為絲氨酸（蘇氨酸）激酶結(jié)構(gòu)域，可催化下游分子在絲氨酸（蘇氨酸）位點發(fā)生磷酸化或者自身磷酸化，進而調(diào)控細胞的生物學(xué)功能。RIPK1的N末端和C末端之間是一段中間結(jié)構(gòu)域，其中有一段為同型相互作用模序（RIP homotypic interaction motif，RHIM），約由35個氨基酸構(gòu)成，能介導(dǎo)同源蛋白間相互作用。RIPK1通過RHIM與同源蛋白RIPK3相互作用，形成壞死復(fù)合體（necrosome），并激活混合性譜系激酶（mixed lineage kinase domain-like，MLKL）和 Caspase-8，使細胞膜完整性破壞，導(dǎo)致細胞死亡。Necrostatin-1是一種合成的化合物，可以特異性抑制RIPK1活性，阻止壞死性凋亡。研究結(jié)果顯示壞死性凋亡參與SAP發(fā)病過程，而給予Necrostatin-1抑制壞死性凋亡后，胰腺炎得到顯著改善（圖3，表2）。

表3 各組胰腺組織內(nèi)RIPK1、RIPK3、MLKL、Caspase-8基因表達情況（±s）

表3 各組胰腺組織內(nèi)RIPK1、RIPK3、MLKL、Caspase-8基因表達情況（±s）

注：與Sham 組比較，aP＜0.001；與PBS 組相比，bP＜0.001

分組 例數(shù) RIPK1 RIPK3 MLKL Caspase-8 NC 組 6 0.45±0.06 0.37±0.09 0.28±0.10 2.51±0.13 Sham 組 6 0.43±0.11 0.40±0.08 0.35±0.16 2.57±0.19 SAP 組 6 1.21±0.09a 0.99±0.13a 1.33±0.11a 0.68±0.14a PBS 組 6 1.31±0.17 0.86±0.09 1.34±0.18 0.78±0.08 BMSCs組 6 0.67±0.13b 0.55±0.07b 0.92±0.12b 1.18±0.14b Nec-1 治療組 6 0.72±0.08b 0.58±0.11b 0.98±0.15b 1.22±0.10b F值 127.681 47.296 141.026 304.882 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖4 胰腺組織內(nèi) RIPK1、RIPK3、MLKL、Caspase-8蛋白表達

干細胞是機體的起源細胞，是形成人體各種組織器官的始祖細胞。組織再生在很大程度上依賴于組織內(nèi)的干細胞，而內(nèi)源性干細胞功能的下降甚至缺失是造成組織器官病變的重要原因之一。BMSCs是一種成體干細胞，具有很強的分化能力和低免疫原性，且容易獲取，有望用于臨床[11]。研究顯示，它具有治療SAP潛能，但確切機理尚未完全闡明[6-8]。Jung等[7]發(fā)現(xiàn)BMSCs通過抑制免疫反應(yīng)來改善SAP；Tu等[8]觀察到BMSCs可以保護腸道功能進而促進SAP修復(fù)。我們前期研究顯示BMSCs通過旁分泌血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）、促血管生成素-1（Ang-1）來促進受損的胰腺組織修復(fù)。本研究中，BMSCs誘導(dǎo)分化（圖1）和流式細胞儀（圖2）結(jié)果均較理想，與相關(guān)文獻報道相似[7,11]，符合BMSCs診斷標(biāo)準(zhǔn)，且筆者觀察到BMSCs移植能夠緩解胰腺組織水腫、滲出、出血和壞死，降低血淀粉酶水平，并可以抑制受損胰腺組織內(nèi) RIPK1、RIPK3、MLKL、Caspase-8表達，抑制壞死性凋亡的發(fā)生（圖4，表3）。

綜上所述，本研究的實驗結(jié)果提示：RIPK1/RIPK3調(diào)控的壞死性凋亡參與了SAP的發(fā)病過程，并可能成為治療SAP的突破點，而BMSCs可能通過抑制RIPK1/RIPK3信號傳遞，阻止壞死性凋亡發(fā)生從而修復(fù)SAP（圖5）。

圖5 間充質(zhì)干細胞通過抑制 RIPK1/RIPK3 調(diào)控的環(huán)死性凋亡發(fā)揮治療作用