中國(guó)人民解放軍器官移植研究所/全軍組織修復(fù)與器官重建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

一、前言

根據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生健康委員會(huì)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定的基本原則，結(jié)合 《中華人民共和國(guó)人類遺傳資源管理?xiàng)l例》、《干細(xì)胞通用要求》、《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》、《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》、《中華人民共和國(guó)藥典》、《環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》、《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》、《實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》、《潔凈室施工及驗(yàn)收規(guī)范》等規(guī)范性文件，制定 《臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、超低溫凍存、復(fù)蘇、移植前制備及其質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)范》，簡(jiǎn)稱間充質(zhì)干細(xì)胞制備及質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)范。

二、范圍

本規(guī)范適用于臨床應(yīng)用級(jí)人體組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的樣本采集、分離培養(yǎng)、擴(kuò)增、超低溫凍存、復(fù)蘇、移植前制備及其與之相關(guān)的質(zhì)量控制。

本文件適用于在GMP潔凈用房條件下人間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、擴(kuò)增、超低溫凍存與復(fù)蘇、移植前制備，以及上述過(guò)程中所涉及的質(zhì)量控制。本文件不適用于基礎(chǔ)研究所涉及的人間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)，也不適用于人體來(lái)源的其他干細(xì)胞（如造血干細(xì)胞等）相關(guān)臨床研究和其他物種的干細(xì)胞分離培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)。

三、規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本規(guī)范的應(yīng)用是必不可少的。凡是標(biāo)注日期的引用文件，僅標(biāo)注日期的版本適用于本規(guī)范。凡是不標(biāo)注日期的文件，其最新版本適用于本規(guī)范。

《中華人民共和國(guó)人類遺傳資源管理?xiàng)l例》、《干細(xì)胞通用要求》、《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》、《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》、《中華人民共和國(guó)藥典》、《環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》、《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊(cè)》、《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》、《實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》、《潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范》、《潔凈室施工及驗(yàn)收規(guī)范》、《中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》。

四、定義和術(shù)語(yǔ)

下列定義和術(shù)語(yǔ)適用于本文件。

（一）間充質(zhì)干細(xì)胞 mesenchymal stem cells

一類來(lái)源于人體中胚層、存在于多種組織（骨髓、臍帶、胎盤、脂肪組織等），具有多向分化和自我更新潛能的非造血類干細(xì)胞。這類干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)形態(tài)呈成纖維細(xì)胞狀，高表達(dá) CD73、CD90、CD105，不表達(dá)或低表達(dá) CD34、CD45、CD14/CD11b、CD79α/CD19、HLA-DR，在特定條件下可分化為骨、軟骨、肌肉及脂肪等細(xì)胞，并具有獨(dú)特的細(xì)胞因子分泌功能，包括分泌細(xì)胞生長(zhǎng)因子、參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)與免疫調(diào)節(jié)的因子等。

（二）臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞clinical grade human mesenchymal stem cells

符合質(zhì)量要求，可用于臨床研究和應(yīng)用的人體多種組織來(lái)源（臍帶、胎盤、骨髓、脂肪等組織）間充質(zhì)干細(xì)胞。

（三）樣本specimen

在特定時(shí)間內(nèi)應(yīng)用特定方法從捐獻(xiàn)者或受試者采集的細(xì)胞、組織、器官等標(biāo)本。

（四）間充質(zhì)干細(xì)胞分離isolation of mesenchymal stem cells

應(yīng)用特定方法，從樣本中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞或目的細(xì)胞的過(guò)程。

（五）間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)primary culture of mesenchymal stem cells

直接取自人體樣本開始，進(jìn)行并在首次傳代之前的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)。

（六）間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增amplif i cation of mesenchymal stem cells

間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后，數(shù)量得到增加的過(guò)程。

（七）間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)subculture of mesenchymal stem cells

當(dāng)間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)成功或細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)到一定程度后，為了避免發(fā)生接觸性抑制，將培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞消化分離成單細(xì)胞懸液后，重新接種到新的培養(yǎng)瓶（培養(yǎng)皿）并進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增的過(guò)程。

（八）間充質(zhì)干細(xì)胞凍存cryopreservation of mesenchymal stem cells

間充質(zhì)干細(xì)胞加入特定的細(xì)胞凍存保護(hù)劑，并經(jīng)過(guò)程序性緩慢降溫過(guò)程，使間充質(zhì)干細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)但仍保持其間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的低溫冷凍過(guò)程。

（九）間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇thawing of mesenchymal stem cells

低溫保存的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)快速升溫過(guò)程，使間充質(zhì)干細(xì)胞從脫離凍存狀態(tài)重新獲得生長(zhǎng)活力的過(guò)程。

（十）間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品medicinal products of mesenchymal stem cells

以經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞為主要成份、并符合相應(yīng)細(xì)胞質(zhì)量要求及安全標(biāo)準(zhǔn)，以明確化學(xué)組成的輔料（平衡液、保護(hù)劑等）為基質(zhì)的，可用于治療臨床疾病或改善人體健康狀況的、具有比較明確生物學(xué)效應(yīng)的間充質(zhì)干細(xì)胞制品。

（十一）間充質(zhì)干細(xì)胞制備 preparation of mesenchymal stem cells

間充質(zhì)干細(xì)胞從新鮮組織樣本中分離后，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)擴(kuò)增，達(dá)到臨床治療的數(shù)量級(jí)，并經(jīng)過(guò)移植前制備等一系列操作過(guò)程，最終能進(jìn)行臨床治療或達(dá)到間充質(zhì)干細(xì)胞入庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)的過(guò)程。

（十二）質(zhì)量控制quality control

為了達(dá)到臨床治療或應(yīng)用的目的，將培養(yǎng)擴(kuò)增后的間充質(zhì)干細(xì)胞按照一定質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)比較分析是否達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的操作過(guò)程。

（十三）倫理審查委員會(huì)ethical review committee

是指負(fù)責(zé)對(duì)臨床相關(guān)科學(xué)研究中所涉及到的倫理道德問(wèn)題進(jìn)行評(píng)估和審查的專門組織。

（十四）生物安全委員會(huì)institutional biosafety committee

是指負(fù)責(zé)制定生物安全政策和安全操作規(guī)范的專門組織。

（十五）知情同意informed consent

是指在重復(fù)獲取相關(guān)信息并準(zhǔn)確理解其內(nèi)容后，具有完全民事行為能力的自然人作出參與或不參與臨床相關(guān)研究的決定，此決定不受恐嚇、利誘或其他不當(dāng)行為的影響。

（十六）實(shí)驗(yàn)室生物安全laboratorial biosafety

為了避免實(shí)驗(yàn)室人員和其他人員以及工作環(huán)境受到不可接受的損傷或損害，實(shí)驗(yàn)室的生物安全條件和狀態(tài)應(yīng)當(dāng)不低于當(dāng)時(shí)國(guó)家規(guī)定的允許水平，且符合國(guó)家相關(guān)法律法規(guī)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全的責(zé)任要求。

五、基本要求

在進(jìn)行人間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)臨床研究之前，干細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)應(yīng)根據(jù) 《中華人民共和國(guó)人類遺傳資源管理?xiàng)l例》、《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》、《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》等法令法規(guī)相關(guān)要求，向國(guó)家有關(guān)部門或單位提出申請(qǐng)或備案，并在獲得相關(guān)部門或單位的審批后方可進(jìn)行人間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床研究。

（一）實(shí)驗(yàn)室選址與設(shè)施

干細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)選址應(yīng)符合GMP要求，環(huán)境空氣質(zhì)量應(yīng)符合國(guó)家相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)要求。

實(shí)驗(yàn)室場(chǎng)地不應(yīng)建設(shè)在地形險(xiǎn)惡、易發(fā)生自然災(zāi)害（如洪水、泥石流、地震等）的區(qū)域，不應(yīng)建設(shè)在近年內(nèi)擬拆遷的建筑內(nèi)以及當(dāng)?shù)卣?guī)劃不明確的區(qū)域，并應(yīng)避開鬧市、噪音、灰塵、空氣等污染源。

實(shí)驗(yàn)室或廠房的設(shè)計(jì)與建設(shè)應(yīng)該是具有潔凈實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)建設(shè)資質(zhì)的設(shè)計(jì)院和/或工程公司設(shè)計(jì)與建造，并應(yīng)符合相關(guān)專業(yè)的規(guī)定。建設(shè)完成后，各功能區(qū)域的潔凈級(jí)別應(yīng)由專業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)并出具合格證明。

干細(xì)胞制備功能區(qū)域應(yīng)按照制備工藝進(jìn)行功能區(qū)域劃分，符合GMP、《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》和 《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，其中潔凈區(qū)和非潔凈區(qū)完全分開，實(shí)行辦公區(qū)域的通風(fēng)系統(tǒng)與實(shí)驗(yàn)區(qū)域的通風(fēng)系統(tǒng)獨(dú)立分開，防止兩者之間相互影響，確保兩個(gè)區(qū)域的空氣質(zhì)量達(dá)到實(shí)驗(yàn)室的基本要求。

干細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)應(yīng)配備獨(dú)立質(zhì)量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，包括但不限于可以進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)、內(nèi)毒素檢測(cè)、支原體檢測(cè)、細(xì)胞流式檢測(cè)分析、臨床遺傳學(xué)檢測(cè)、動(dòng)物試驗(yàn)、PCR檢測(cè)等相關(guān)實(shí)驗(yàn)室，并符合相應(yīng)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)定要求。

（二）儀器設(shè)備和試劑耗材

應(yīng)優(yōu)先選用符合GMP、《干細(xì)胞通用要求》、《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》和 《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求的設(shè)備、儀器、試劑和耗材，并盡量選用獲得國(guó)家資質(zhì)認(rèn)證的設(shè)備、儀器、試劑和耗材。若沒有獲得國(guó)家資質(zhì)認(rèn)證的，應(yīng)說(shuō)明原因并選用當(dāng)前最高等級(jí)的資質(zhì)認(rèn)證許可的設(shè)備、儀器、試劑和耗材。

實(shí)驗(yàn)室或依托單位應(yīng)對(duì)設(shè)備、儀器、試劑和耗材供應(yīng)商進(jìn)行資質(zhì)審核認(rèn)證，要求供應(yīng)商提供產(chǎn)品質(zhì)量報(bào)告和批次檢驗(yàn)報(bào)告，并對(duì)試劑和耗材進(jìn)行質(zhì)量抽檢，避免采購(gòu)質(zhì)量不合格的產(chǎn)品。

所有與人間充質(zhì)干細(xì)胞制備相關(guān)的設(shè)備和儀器正式使用前應(yīng)做安裝確認(rèn)、運(yùn)行確認(rèn)和性能確認(rèn)，并定期進(jìn)行第三方校準(zhǔn)。所有計(jì)量?jī)x器，如離心機(jī)、冰箱、天平、移液器等，首次使用前均需經(jīng)計(jì)量檢測(cè)部門檢測(cè)合格后方可使用，并定期進(jìn)行檢測(cè)和記錄。不得使用有安全隱患的儀器操作樣本及細(xì)胞制品。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)設(shè)備和儀器進(jìn)行編號(hào)建檔，并建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程（SOP），確保使用、運(yùn)行、保養(yǎng)、維修記錄完整可追溯。當(dāng)儀器設(shè)備出現(xiàn)異常和（或）故障時(shí)，使用人應(yīng)立即報(bào)告，并啟動(dòng)應(yīng)急預(yù)案，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)及時(shí)指派人員對(duì)狀態(tài)異常的設(shè)備進(jìn)行校對(duì)和維修。

（三）生物安全與倫理

干細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)應(yīng)成立倫理審查委員會(huì)，該審查委員會(huì)應(yīng)當(dāng)由醫(yī)學(xué)、倫理學(xué)、法學(xué)專家等人員組成，負(fù)責(zé)討論相關(guān)臨床研究所涉及的樣本采集倫理問(wèn)題，并進(jìn)行審查和評(píng)價(jià)。同時(shí)應(yīng)按照國(guó)家相關(guān)法律法規(guī)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求，制定干細(xì)胞相關(guān)倫理準(zhǔn)則和相應(yīng)的操作規(guī)范，以保護(hù)樣本提供者或受試者的權(quán)益和安全。

干細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)同時(shí)應(yīng)成立生物安全評(píng)審委員會(huì)，該評(píng)審委員會(huì)應(yīng)當(dāng)由生物學(xué)家、醫(yī)學(xué)專家、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員和相關(guān)管理人員等組成，應(yīng)當(dāng)制定符合 《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊(cè)》和國(guó)家相關(guān)機(jī)構(gòu)規(guī)定的生物危害評(píng)估方案、生物安全事故應(yīng)急預(yù)案等安全管理措施。負(fù)責(zé)人間充質(zhì)干細(xì)胞制備的生物安全和相關(guān)操作規(guī)范的審查，避免不必要的操作，保護(hù)供者及樣本安全。

干細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)的工作人員應(yīng)遵從醫(yī)學(xué)倫理學(xué)四大原則（尊重自主、行善、無(wú)害、公正），對(duì)風(fēng)險(xiǎn)及收益進(jìn)行有效評(píng)估，保障樣本提供者或其近親屬對(duì)該研究項(xiàng)目的相關(guān)信息充分知情、能達(dá)到全面和準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)，自愿作出參與或不參與樣本采集的決定，并簽署相關(guān)知情同意書。

凡是接觸到樣本捐獻(xiàn)者或提供者個(gè)人相關(guān)信息的人員（包括樣本采集人員、捐獻(xiàn)者主治醫(yī)師和護(hù)士、實(shí)驗(yàn)室操作人員和管理人員等）應(yīng)當(dāng)對(duì)捐獻(xiàn)者的個(gè)人信息采取嚴(yán)格保密措施，防止意外泄露，絕不允許有意泄露；若研究中確實(shí)需要上述相關(guān)信息，需經(jīng)過(guò)有關(guān)程序進(jìn)行申請(qǐng)并提交倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意后方可實(shí)施。違反法律規(guī)定的，應(yīng)依法追究泄密人員相應(yīng)的民事責(zé)任、行政責(zé)任或刑事責(zé)任。

（四）實(shí)驗(yàn)室人員管理

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分別設(shè)立間充質(zhì)干細(xì)胞制備負(fù)責(zé)人、質(zhì)量管理負(fù)責(zé)人以及間充質(zhì)干細(xì)胞制備操作人員、質(zhì)控員、試劑耗材驗(yàn)收人員等崗位。任職資質(zhì)應(yīng)符合GMP、《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》和 《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，定期接受崗位專業(yè)培訓(xùn)。

技術(shù)人員應(yīng)具備的健康要求：HBsAg和針對(duì)HAV、HCV、HIV及梅毒的抗體檢測(cè)應(yīng)為陰性，并且（矯正）視力正常，無(wú)色盲、色弱。技術(shù)人員須至少一年接受一次體檢，有呼吸道感染或發(fā)熱等疾病狀態(tài)下不得進(jìn)入潔凈操作區(qū)，需完全康復(fù)后方可恢復(fù)崗位操作。

技術(shù)人員上崗前應(yīng)經(jīng)過(guò)相關(guān)專業(yè)知識(shí)和其他內(nèi)容的培訓(xùn)，主要內(nèi)容包括細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)、干細(xì)胞理論與臨床相關(guān)知識(shí)、GMP管理、GCP資質(zhì)認(rèn)證、倫理學(xué)、生物安全、儀器設(shè)備使用與維護(hù)、實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)定、個(gè)人崗位職責(zé)、實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范等。

（五）文件管理

干細(xì)胞制備方或相關(guān)機(jī)構(gòu)對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞臨床研究所涉及的標(biāo)準(zhǔn)操作文件應(yīng)包括樣本的采集、運(yùn)輸、接收，間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增、超低溫凍存和復(fù)蘇，間充質(zhì)干細(xì)胞移植前制備以及與此相關(guān)的質(zhì)量控制等所有操作流程與步驟，并能夠正確指導(dǎo)和規(guī)范相關(guān)操作人員的實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程。

干細(xì)胞制備方或相關(guān)機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)制定制備過(guò)程中所涉及的各種操作過(guò)程的各類表格，并做到記錄完整可靠，應(yīng)當(dāng)可溯源。對(duì)所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)和信息進(jìn)行詳細(xì)的記錄并保存，保存時(shí)間至少30年。關(guān)鍵數(shù)據(jù)信息應(yīng)進(jìn)行電子備份保存。

六、操作規(guī)范

（一）總則

人體細(xì)胞組織樣本的采集運(yùn)輸、間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增、超低溫凍存及復(fù)蘇、移植前制備等相關(guān)的操作過(guò)程應(yīng)建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范，并應(yīng)當(dāng)符合相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和要求，操作人員應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范執(zhí)行。間充質(zhì)干細(xì)胞樣本的采集須由具有相關(guān)專業(yè)知識(shí)的醫(yī)護(hù)人員完成，間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)到移植前制備等操作過(guò)程須由經(jīng)過(guò)相關(guān)專業(yè)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員完成。

（二）樣本采集

1.捐獻(xiàn)者的健康要求：間充質(zhì)干細(xì)胞提供者應(yīng)無(wú)惡性腫瘤病史、血液系統(tǒng)疾病、性傳播疾病及相關(guān)高危人群史、吸毒史或其他遺傳性疾病；HBV、HCV、HIV、TP、EBV、CMV、HTLV等病原學(xué)檢測(cè)應(yīng)為陰性。采集人員應(yīng)對(duì)捐獻(xiàn)者的基本信息與相關(guān)健康信息進(jìn)行詳細(xì)咨詢，并作好記錄，同時(shí)做好對(duì)捐獻(xiàn)者或提供者的隱私保護(hù)工作。

2.采集場(chǎng)所：人體組織樣本的采集場(chǎng)所或環(huán)境一般為潔凈手術(shù)室，需按照無(wú)菌操作技術(shù)采集樣本。人骨髓以及新生兒臍帶、胎盤組織樣本的采集場(chǎng)所應(yīng)在Ⅱ級(jí)及以上標(biāo)準(zhǔn)潔凈手術(shù)室進(jìn)行操作，人脂肪組織樣本的采集場(chǎng)所應(yīng)在Ⅲ級(jí)及以上手術(shù)室進(jìn)行操作。

3.采集方法：（1）新生兒臍帶組織：新生兒臍帶組織樣本采集應(yīng)由經(jīng)過(guò)嚴(yán)格相關(guān)專業(yè)培訓(xùn)的護(hù)士或助產(chǎn)士職稱以上醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行操作，并按無(wú)菌要求進(jìn)行。待產(chǎn)婦娩出胎兒后，在距胎兒臍部的適當(dāng)位置，用止血鉗分別夾住臍帶上下兩端，消毒劑消毒臍帶，并用消毒剪刀于兩鉗中間斷臍。至少應(yīng)留取長(zhǎng)度為15 cm無(wú)破損的臍帶，截取臍帶樣本置于無(wú)菌采集瓶中，同時(shí)加入生理鹽水或磷酸鹽緩沖液等樣本保存液，液面至少在浸沒的臍帶組織以上。采集瓶密閉包裝。（2）新生兒胎盤組織：新生兒胎盤組織采集應(yīng)由經(jīng)嚴(yán)格專業(yè)培訓(xùn)的護(hù)士或助產(chǎn)士職稱以上醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行操作，并按無(wú)菌要求進(jìn)行。胎兒娩出后，待胎盤與母體完全分離，先用生理鹽水充分淋洗胎盤，然后用75%醫(yī)用酒精快速?zèng)_洗表面，最后用生理鹽水充分淋洗胎盤。迅速將胎盤放入胎盤采集盒或采集袋中，加入適量生理鹽水或磷酸鹽緩沖液等樣本保存液，液面至少在浸沒的胎盤以上。采集瓶或采集盒密閉包裝。（3）脂肪組織：脂肪組織采集應(yīng)由臨床醫(yī)師制定抽取方案和術(shù)前術(shù)后的防感染處理措施。由臨床醫(yī)師按要求行脂肪抽吸術(shù)，抽取臍周或大腿的脂肪組織，置于無(wú)菌采集瓶或其它無(wú)菌容器中保存。采集瓶或其它無(wú)菌容器密閉包裝。（4）骨髓組織：骨髓采集前應(yīng)由具有專業(yè)知識(shí)、且有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師或住院醫(yī)師規(guī)范化培訓(xùn)合格者進(jìn)行制定骨髓穿刺方案和術(shù)前術(shù)后的防感染處理措施。由具有專業(yè)知識(shí)、且有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師或住院醫(yī)師規(guī)范化培訓(xùn)合格的醫(yī)師行骨髓穿刺術(shù)，抽取骨髓液至含抗凝劑的針管內(nèi)，即時(shí)轉(zhuǎn)移至無(wú)菌采集瓶中保存。采集瓶密閉包裝。在操作過(guò)程中，還應(yīng)避免采集到稀釋的骨髓液。

（三）樣本運(yùn)輸

樣本運(yùn)輸人員應(yīng)是經(jīng)過(guò)相關(guān)專業(yè)培訓(xùn)且考核合格的人員，對(duì)樣本運(yùn)輸應(yīng)制定操作規(guī)程（SOP）及應(yīng)急預(yù)案。

樣本運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)采取抗震動(dòng)、耐壓、耐熱等保護(hù)措施，同時(shí)應(yīng)做好防滲漏、防輻射等，樣本包裝盒上需粘貼相應(yīng)標(biāo)簽標(biāo)識(shí)。樣本運(yùn)輸應(yīng)采用常溫條件進(jìn)行，若運(yùn)輸距離過(guò)遠(yuǎn)，則應(yīng)采用2℃～8℃保存條件進(jìn)行運(yùn)輸，并應(yīng)用平穩(wěn)、安全運(yùn)輸途經(jīng)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，其中骨髓液樣本的最長(zhǎng)時(shí)間不超過(guò)6 h，脂肪組織的最長(zhǎng)時(shí)間不超過(guò)12 h，臍帶和胎盤組織的最長(zhǎng)時(shí)間不超過(guò)24 h。

（四）樣本接收

樣本接收人員應(yīng)是經(jīng)過(guò)干細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)，或由干細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)委托的培訓(xùn)機(jī)構(gòu)經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)且考核合格的人員，應(yīng)遵從安全與準(zhǔn)確的原則、遵照樣本接收的規(guī)定及應(yīng)急預(yù)案對(duì)樣本進(jìn)行接收，并對(duì)接收過(guò)程進(jìn)行記錄。

樣本接收時(shí)，接收人員應(yīng)做好自我防護(hù)工作，接觸樣本之前應(yīng)戴手套與口罩，并對(duì)接收?qǐng)鏊M(jìn)行消毒處理。

接收樣本后應(yīng)檢查樣本容器外包裝是否完整，核對(duì)樣本采集信息記錄是否齊全和完整，檢查記錄信息是否與樣本信息一一對(duì)應(yīng)，確認(rèn)無(wú)誤后才能簽字接收。

樣本接收后，使用75%醫(yī)用酒精消毒清理容器外表面，如不能及時(shí)對(duì)樣本進(jìn)行處理，需將樣本保存在2 ℃～8 ℃條件下，其中骨髓液樣本的最長(zhǎng)時(shí)間不超過(guò)6 h，脂肪組織的最長(zhǎng)時(shí)間不超過(guò)12 h，臍帶和胎盤組織的最長(zhǎng)時(shí)間不超過(guò)24 h。

樣本接收后應(yīng)及時(shí)將信息反饋給樣本發(fā)送方。若接收樣本不符合相關(guān)要求，應(yīng)按照樣本拒收標(biāo)準(zhǔn)處理組織樣本，并及時(shí)通知有關(guān)部門或負(fù)責(zé)人，同時(shí)做好相應(yīng)記錄。

（五）干細(xì)胞分離與培養(yǎng)

1.基本要求：（1）間充質(zhì)干細(xì)胞分離與培養(yǎng)應(yīng)在符合GMP、《干細(xì)胞通用要求》、《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》和 《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求的潔凈用房?jī)?nèi)進(jìn)行。（2）所有操作需事先制定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），由經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)的技術(shù)人員嚴(yán)格遵照?qǐng)?zhí)行，并進(jìn)行記錄登記。分離與培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)標(biāo)識(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞的名稱、代次、批次、操作日期、培養(yǎng)條件、操作人員姓名等信息。（3）所使用試劑應(yīng)盡量采用符合國(guó)家GMP、《中華人民共和國(guó)藥典》、《干細(xì)胞通用要求》和 《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求的藥品輔料或已獲批的藥品，應(yīng)出具產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)合格報(bào)告，并對(duì)各批次試劑進(jìn)行質(zhì)量抽檢。（4）盡可能避免人源或動(dòng)物源性血清，不得使用同種異體人血清或血漿。如必須使用動(dòng)物血清，應(yīng)確保其無(wú)特定動(dòng)物源性病毒污染。嚴(yán)禁使用海綿體狀腦病流行區(qū)來(lái)源的牛血清。

2.分離與培養(yǎng)方法：（1）臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞：在生物安全柜或超凈工作臺(tái)內(nèi)取出臍帶，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液清洗至少2次，用無(wú)菌醫(yī)療器械（止血鉗、鑷子等）去除新生兒臍帶組織的血管、外皮等組織，盡可能保留華通氏膠，用組織剪將組織剪碎，以組織塊貼壁法或膠原酶消化法分離新生兒臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。采用貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行新生兒臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)。（2）胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞：在生物安全柜或超凈工作臺(tái)內(nèi)取出胎盤組織，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液清洗至少2次，用無(wú)菌醫(yī)療器械（止血鉗、鑷子等）去除胎盤羊膜、絨毛膜及絨毛組織，剪取臍帶近端的胎盤組織，以膠原酶消化法分離胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。采用貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行新生兒胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)。（3）脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞：在生物安全柜或超凈工作臺(tái)內(nèi)取出脂肪組織，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液清洗至少2次，用無(wú)菌剪刀將脂肪組織剪碎成1 mm3，并用膠原酶消化法分離脂肪組織間充質(zhì)干細(xì)胞。采用貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)。（4）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：在生物安全柜或超凈工作臺(tái)內(nèi)取出人骨髓液樣本，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液稀釋后，以密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞。采用貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)。

（六）間充質(zhì)干細(xì)胞換液

間充質(zhì)干細(xì)胞換液操作需嚴(yán)格遵照GMP、《干細(xì)胞通用要求》、《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》和 《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，保證無(wú)外源性微生物污染，相關(guān)操作均進(jìn)行記錄。

細(xì)胞換液時(shí)間及頻次需根據(jù)人間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)情況及培養(yǎng)基的顏色變化進(jìn)行判定，來(lái)確保人間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)水平，并消除代謝物的毒害作用。

換液操作時(shí)吸棄培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中部分或全部培養(yǎng)基，再加入適量新鮮配制的培養(yǎng)基。首次換液需要在顯微鏡下觀察到原代細(xì)胞完全貼壁和延伸后方可進(jìn)行。

培養(yǎng)基成份應(yīng)符合臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞分離與培養(yǎng)基本要求，盡量采用已獲國(guó)家批準(zhǔn)的臨床級(jí)產(chǎn)品或藥品輔料。

（七）間充質(zhì)干細(xì)胞傳代

間充質(zhì)干細(xì)胞傳代操作應(yīng)嚴(yán)格遵照GMP、《干細(xì)胞通用要求》、《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》和 《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，保證無(wú)外源性微生物污染，相關(guān)操作均進(jìn)行記錄。

一般情況下培養(yǎng)后間充質(zhì)干細(xì)胞的融合度達(dá)到80%～90%可進(jìn)行傳代操作，傳代時(shí)應(yīng)密度適宜、及時(shí)迅速。傳代所使用消化酶應(yīng)符合臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞分離與培養(yǎng)基本要求，盡量采用已獲國(guó)家批準(zhǔn)的臨床級(jí)產(chǎn)品。如必須使用動(dòng)物源性消化酶，應(yīng)確保其無(wú)特定動(dòng)物源性病毒污染。

（八）間充質(zhì)干細(xì)胞凍存

間充質(zhì)干細(xì)胞凍存操作應(yīng)嚴(yán)格遵照GMP、《干細(xì)胞通用要求》、《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》和 《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，保證無(wú)外源性微生物污染，相關(guān)操作均進(jìn)行記錄。

經(jīng)過(guò)培養(yǎng)擴(kuò)增其數(shù)量達(dá)到凍存要求的人間充質(zhì)干細(xì)胞可進(jìn)行凍存相關(guān)操作，需凍存人間充質(zhì)干細(xì)胞必須加入適量的干細(xì)胞凍存保護(hù)劑，并遵循程序性降溫原則，最后放入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

間充質(zhì)干細(xì)胞凍存保護(hù)劑的成份應(yīng)符合臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞分離與培養(yǎng)基本要求，盡量采用已獲國(guó)家批準(zhǔn)的臨床級(jí)產(chǎn)品或藥品輔料，其中二甲基亞砜的體積比例應(yīng)不超過(guò)最終總體積的10%。

凍存細(xì)胞應(yīng)明確標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞名稱、培養(yǎng)條件、代次、批次、操作人員、凍存日期等信息，并具有唯一標(biāo)識(shí)。

液氮凍存應(yīng)使用符合實(shí)驗(yàn)要求的液氮容器，由專人負(fù)責(zé)，保證液氮供應(yīng)充足，溫度恒定。

（九）間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇

間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇操作應(yīng)嚴(yán)格遵照GMP、《干細(xì)胞通用要求》、《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》和 《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，保證無(wú)外源性微生物污染，相關(guān)操作均進(jìn)行記錄。

從液氮罐或液氮儲(chǔ)存箱中取出裝有目的細(xì)胞的凍存管，迅速核對(duì)信息并檢查凍存管是否出現(xiàn)泄漏。待管內(nèi)凍存物完全融化后，輕搖混勻，并用消毒劑擦拭凍存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)明確標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞名稱、培養(yǎng)條件、代次、批次、操作人員、復(fù)蘇日期等信息。

（十）間充質(zhì)干細(xì)胞移植前制備

間充質(zhì)干細(xì)胞移植前制備操作應(yīng)嚴(yán)格遵照GMP、《干細(xì)胞通用要求》、《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，保證無(wú)外源性微生物污染，相關(guān)操作均進(jìn)行記錄。

間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品主要成份應(yīng)為質(zhì)量檢驗(yàn)合格的臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞，以及生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、或間充質(zhì)干細(xì)胞懸浮液等，其余成份應(yīng)符合 《中華人民共和國(guó)藥典》、《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》、《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》等文件對(duì)藥品輔料和試劑的要求，避免對(duì)干細(xì)胞的滲透壓、形態(tài)、功能等生物學(xué)特性產(chǎn)生影響。間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品按要求包裝完畢，應(yīng)留樣進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)和內(nèi)毒素檢測(cè)。

間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品的細(xì)胞密度、最終體積、是否含有抗凝劑及劑量、包裝要求等，均需按照臨床應(yīng)用的要求來(lái)完成，根據(jù)臨床上移植方式（靜脈輸注、血管介入、腰穿注射、局部注射或涂抹等）的不同，選擇不同的細(xì)胞密度、最終體積等來(lái)滿足臨床的需求。

使用前詳細(xì)檢查間充質(zhì)干細(xì)胞制劑外觀，應(yīng)為均質(zhì)狀態(tài)，無(wú)明顯絮狀沉淀。若出現(xiàn)絮狀沉淀，應(yīng)充分振蕩混勻。

（十一）間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品運(yùn)輸

制備完成、且包裝嚴(yán)密的間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品運(yùn)輸應(yīng)由經(jīng)過(guò)相關(guān)專業(yè)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)行運(yùn)送，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品運(yùn)輸應(yīng)制定操作規(guī)程（SOP）及應(yīng)急預(yù)案。

間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)采取抗震動(dòng)、耐壓、耐熱等保護(hù)措施，同時(shí)應(yīng)做好防滲漏、防輻射等，包裝盒上需粘貼相應(yīng)標(biāo)簽標(biāo)識(shí)。間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品運(yùn)輸應(yīng)采用常溫條件進(jìn)行，并應(yīng)用平穩(wěn)、安全運(yùn)輸途經(jīng)快速送達(dá)臨床小組通知的位置。

送達(dá)后經(jīng)臨床醫(yī)師或護(hù)士檢查核對(duì)，準(zhǔn)確無(wú)誤后交接并簽名。從實(shí)驗(yàn)室將間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品制備完畢，到臨床完成移植過(guò)程，應(yīng)以控制在8 h內(nèi)為最佳。

七、質(zhì)量控制和質(zhì)量研究

（一）間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性

1.細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)：光學(xué)顯微鏡下觀察，間充質(zhì)干細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，單個(gè)或散在的人間充質(zhì)干細(xì)胞呈三角形、類星形等多種形態(tài)，密集生長(zhǎng)時(shí)為長(zhǎng)梭形纖維細(xì)胞樣，呈旋渦狀、火焰狀或魚群狀排列，形態(tài)均一。

2.表面標(biāo)志物檢測(cè)：采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)定，人間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD73、CD90、CD105呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率大于等于 95%；CD34、CD45、CD11b/CD14、CD79α/CD19、HLA-DR呈陰性表達(dá)，陽(yáng)性率小于2%。

3.分化能力檢測(cè)：采用特定的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下，人間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)具有多向分化潛能，可分別分化為成脂肪、成骨、成軟骨細(xì)胞。成脂分化經(jīng)油紅O染色法鑒定，成骨分化經(jīng)茜素紅染色法鑒定，成軟骨分化經(jīng)阿爾辛藍(lán)染色法鑒定。

4.染色體核型檢測(cè)：采用G帶分析法進(jìn)行檢測(cè)，人間充質(zhì)干細(xì)胞染色體數(shù)量應(yīng)為46（含XX/XY），無(wú)染色體缺失、異位和重排。

（二）間充質(zhì)干細(xì)胞安全性

1.無(wú)菌試驗(yàn)：參照 《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》、《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》等文件要求，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞樣本采集、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇、以及移植前制備等過(guò)程進(jìn)行留樣檢測(cè)。細(xì)菌和真菌培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果均應(yīng)為陰性。

2.支原體檢測(cè)：參照 《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》、《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》等文件要求，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞樣本采集、分離、培養(yǎng)、凍存等過(guò)程進(jìn)行留樣檢測(cè)。支原體檢測(cè)結(jié)果均應(yīng)陰性。

3.內(nèi)毒素檢測(cè)：參照 《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》、《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》等文件要求，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞樣本采集、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇、以及移植前制備等過(guò)程進(jìn)行留樣檢測(cè)。各種樣本中的內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果均應(yīng)≤0.5 EU/ml。

（三）間充質(zhì)干細(xì)胞穩(wěn)定性

1.存活率檢測(cè)：采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法或吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）熒光雙染法檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞存活率，各代數(shù)及各批次的間充質(zhì)干細(xì)胞活細(xì)胞比例≥90%。

2.生長(zhǎng)活性檢測(cè)：通過(guò)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的倍增時(shí)間、細(xì)胞周期、以及端粒酶活性，來(lái)評(píng)估細(xì)胞的生長(zhǎng)活性，各代數(shù)及各批次的間充質(zhì)干細(xì)胞活細(xì)胞應(yīng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，G0期細(xì)胞數(shù)≤10%，具有端粒酶活性。

3.細(xì)胞純度檢測(cè)：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物（CD抗原），各代數(shù)及各批次的間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)均應(yīng)符合流式檢測(cè)比例要求。

（四）間充質(zhì)干細(xì)胞的質(zhì)量研究

1.細(xì)胞均一性檢測(cè)：采用PCR方法檢測(cè)分析細(xì)胞的人基因組DNA短片斷重復(fù)序列（STR），同一細(xì)胞系來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞各代數(shù)及各批次的STR檢測(cè)結(jié)果應(yīng)保持一致。

2.細(xì)胞內(nèi)外源致病因子檢測(cè)：采用血清ELISA檢測(cè)法或采用PCR檢測(cè)核酸法，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞樣本采集、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等過(guò)程進(jìn)行留樣檢測(cè)。HIV抗體、HBsAg、HCV抗體、TP抗體、CMV-IgM、HTLV抗體、HPV抗體、EBV抗體檢測(cè)均應(yīng)為陰性；HCV、HBV、HIV病毒核酸檢測(cè)均應(yīng)為陰性。

3.異常免疫學(xué)反應(yīng)檢測(cè)：采用流式細(xì)胞術(shù)以及ELISA技術(shù)，測(cè)定異體來(lái)源的人間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于活化的人總淋巴細(xì)胞的增殖和對(duì)不同淋巴細(xì)胞亞群增殖能力的影響，以及對(duì)淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響。淋巴細(xì)胞亞群應(yīng)無(wú)異常增殖，細(xì)胞因子表達(dá)水平應(yīng)無(wú)異常增加。

4.免疫調(diào)節(jié)功能檢測(cè)：采用ELISA和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)炎癥因子誘導(dǎo)后的間充質(zhì)干細(xì)胞中吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）的表達(dá)和功能，以及對(duì)于活化的人總淋巴細(xì)胞的增殖和對(duì)不同淋巴細(xì)胞亞群增殖能力的影響。間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后應(yīng)表達(dá)IDO，并能抑制淋巴細(xì)胞增殖。

5.致瘤性檢測(cè)：可分為體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)），其中體外試驗(yàn)采用細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)；體內(nèi)試驗(yàn)采用免疫缺陷動(dòng)物（裸小鼠或SCID小鼠），通過(guò)局部注射或尾靜脈注射方式接種人間充質(zhì)干細(xì)胞，評(píng)估人間充質(zhì)干細(xì)胞的致瘤性。體內(nèi)致瘤試驗(yàn)應(yīng)嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的科學(xué)研究和倫理要求進(jìn)行，單只小鼠的細(xì)胞接種量應(yīng)≥106細(xì)胞/kg，觀察時(shí)間應(yīng)≥8周。臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞的克隆形成試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陰性，體內(nèi)試驗(yàn)應(yīng)無(wú)致瘤性。

6.培養(yǎng)基及其他添加成份殘余量檢測(cè)：參照《中華人民共和國(guó)藥典》、《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》、《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》等文件要求執(zhí)行，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞樣本采集、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇、以及移植前制備等過(guò)程進(jìn)行留樣檢測(cè)。各種樣本中的BSA殘留量均應(yīng)小于50 ng/ml。

（五）質(zhì)量檢驗(yàn)

1.批次質(zhì)量檢驗(yàn)：干細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)應(yīng)對(duì)由同一供體、同一組織來(lái)源、同一時(shí)間、使用同一方法采集和分離獲得的干細(xì)胞制劑進(jìn)行例行批次質(zhì)量檢驗(yàn)。為確保制劑工藝和質(zhì)量的穩(wěn)定性，須對(duì)多批次干細(xì)胞制劑進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，同時(shí)應(yīng)對(duì)至少三個(gè)批次的間充質(zhì)干細(xì)胞送第三方實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)質(zhì)量復(fù)核檢驗(yàn)，并出具相應(yīng)檢測(cè)報(bào)告，檢測(cè)合格后方可進(jìn)行進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)。當(dāng)制備工藝、試劑、耗材、場(chǎng)地等條件發(fā)生改變時(shí)，制備方應(yīng)對(duì)多批次干細(xì)胞制劑進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，同時(shí)應(yīng)對(duì)至少三個(gè)批次的間充質(zhì)干細(xì)胞送第三方實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)質(zhì)量復(fù)核檢驗(yàn)，確保工藝和質(zhì)量穩(wěn)定可靠，記錄入檔保存。記錄方式應(yīng)同時(shí)采用電子信息管理系統(tǒng)和填寫紙質(zhì)登記表，可相互驗(yàn)證是否存在缺漏和不足。

2.放行質(zhì)量檢驗(yàn)：每一批次臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床使用前應(yīng)在完成例行質(zhì)量檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)上述質(zhì)量檢驗(yàn)各項(xiàng)目中所明確的檢驗(yàn)內(nèi)容及標(biāo)準(zhǔn)，制定放行檢驗(yàn)項(xiàng)目及標(biāo)準(zhǔn)。放行檢驗(yàn)項(xiàng)目應(yīng)能在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)，反映細(xì)胞制劑的質(zhì)量及安全信息。質(zhì)量檢驗(yàn)內(nèi)容應(yīng)包括但不限于細(xì)胞活率、細(xì)菌、真菌和內(nèi)毒素含量檢測(cè)等，確認(rèn)制劑合格后方可申請(qǐng)臨床放行使用，并應(yīng)留取少量樣本長(zhǎng)期保存?zhèn)洳?。相關(guān)記錄和報(bào)告應(yīng)入檔保存。

3.復(fù)核質(zhì)量檢驗(yàn)：干細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)應(yīng)對(duì)每一批次干細(xì)胞制劑單獨(dú)留樣保存，詳細(xì)記錄批號(hào)、代次、生產(chǎn)日期、來(lái)源等信息。定期由國(guó)家或地方相關(guān)部門授權(quán)的專業(yè)細(xì)胞檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的質(zhì)量復(fù)核檢驗(yàn)，并出具檢驗(yàn)報(bào)告，入檔保存。復(fù)核質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告出具時(shí)間應(yīng)在該批次臨床級(jí)人間充質(zhì)干細(xì)胞制劑提出放行申請(qǐng)之前，并作為放行檢驗(yàn)參考。

主要參編人員：黃梁滸、陳津、付云烽、林娜、趙紅州、施小華、譚建明

本文附錄

附錄A：（資料性附錄）實(shí)驗(yàn)室間充質(zhì)干細(xì)胞制備基本流程

附錄B：（資料性附錄）臍帶/胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)登記表

附錄C：（資料性附錄）骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離培養(yǎng)登記表

附錄A

（資料性附錄）

實(shí)驗(yàn)室間充質(zhì)干細(xì)胞制備基本流程

附錄B

（資料性附錄）

臍帶/胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)登記表

捐獻(xiàn)者/委托人基本信息： 簽名：產(chǎn)婦姓名 民族 年齡身份證號(hào)碼聯(lián)系電話聯(lián)系地址委托人姓名 民族 年齡身份證號(hào)碼聯(lián)系電話聯(lián)系地址病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果：病歷號(hào)（ID） ABO血型 Rh血型HBsAg HCV HIV梅毒 HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb CMV其他獲取組織：□ 胎盤 □ 臍帶 □ 胎盤 + 臍帶 □ 其它臍帶分離情況：臍帶長(zhǎng)度臍帶留取時(shí)間保存方式 實(shí)驗(yàn)室分離時(shí)間是否含臍帶血 分離前消毒處理是否去除臍帶外膜 剪碎后組織體積PBS洗滌 消化酶消化時(shí)間 消化后PBS洗滌細(xì)胞接種 □ 15 cm培養(yǎng)皿 □ 75cm2培養(yǎng)瓶 □ 其它胎盤分離情況：胎盤重量血液含量剪取胎盤組織重量 生理鹽水洗滌剪碎后組織體積 PBS洗滌消化酶 消化時(shí)間消化后PBS洗滌 細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞接種 □ 15 cm培養(yǎng)皿 □ 75 cm2培養(yǎng)瓶 □ 其它備注：

附錄C

（資料性附錄）

骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離培養(yǎng)登記表

捐獻(xiàn)者基本信息：主管醫(yī)師簽名：捐獻(xiàn)者姓名 性別 年齡民族 體重身份證號(hào)碼聯(lián)系電話聯(lián)系地址病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果：病歷號(hào)（ID） ABO血型 Rh血型HBsAg HCV HIV梅毒 HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb CMV其他骨髓抽取預(yù)約日期骨髓抽取計(jì)劃量骨髓抽取信息：術(shù)者簽名：穿刺點(diǎn)1： □髂骨后 □髂骨前 □其他部位________穿刺點(diǎn)2： □髂骨后 □髂骨前 □其他部位________肝素用量骨髓液體積總體積骨髓細(xì)胞分離情況： 實(shí)驗(yàn)室人員簽名：骨髓是否有凝塊 □無(wú) □少量 □較多標(biāo)本是否退回臨床實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人簽名離心后血漿體積 稀釋用PBS體積Ficoll加入量 細(xì)胞分層離心速度離心時(shí)間 分層是否完整清晰分層后PBS洗滌 單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞接種 □ 15 cm培養(yǎng)皿 □ 75 cm2培養(yǎng)瓶 □其它備注：