李馳坤，歐喜燕，張永和，陳聲武，李曉兵

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130000）

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供的清潔級(jí)Wistar大鼠，雌、雄大鼠比例為1：1，體重250～280 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

（1）苦心丸（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心生產(chǎn)，0.3 g/粒，含生藥8.3 g，批號(hào)20100201）；（2）復(fù)方丹參滴（天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)，27 mg/粒，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10950111，批號(hào)100309）；（3）試劑：烏來糖，分析純，500 g/瓶，批號(hào)T20100310，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)30191228；注射用青霉素鈉，規(guī)格：160萬單位/瓶，國(guó)藥準(zhǔn)字H13020655，生產(chǎn)批號(hào)：E1005503，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)。大鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（Glut4）試劑盒，規(guī)格：96T，上?？泼羯锟萍加邢薰旧a(chǎn)，批號(hào)20120602；大鼠磷酸化AKT蛋白（AKT）ELISA試劑盒，96T，上?？泼羯锟萍加邢薰旧a(chǎn)，批號(hào)20120602。

1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器

酶標(biāo)儀：BIO680，美國(guó)伯樂公司產(chǎn)品；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：型號(hào)：Biofuge stratos，德國(guó)SORVALL產(chǎn)品；熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，型號(hào)：DHG-9003BS-Ⅲ型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 實(shí)驗(yàn)分組

按隨機(jī)方式將實(shí)驗(yàn)大鼠分成6組，即假手術(shù)組、模型組、陽性對(duì)照組（復(fù)方丹參滴丸）、苦心丸高、中、低劑量各1組，每組中均包含5只雌大鼠、5只雄大鼠。

2.1.2 給藥途徑、方法及劑量

實(shí)驗(yàn)大鼠均通過灌胃方式給藥，劑量如下：苦心丸高、中、低劑量組分別為1.48 g/kg、0.74 g/kg、0.37 g/kg體重；陽性對(duì)照藥組用藥為復(fù)方丹參滴丸，劑量為250 mg/kg體重。以上各組給藥均為1次/d，共連續(xù)7 d，第7 d給藥后30 min進(jìn)行心肌缺血模型的復(fù)制。

2.1.3 大鼠心肌缺血模型復(fù)制方法

按照文獻(xiàn)中描述的結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)再進(jìn)行心肌缺血模型的復(fù)制。

首先使用乙醚將實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉，選定胸正中為手術(shù)區(qū)域，去毛備皮消毒，做好關(guān)閉胸腔的荷包縫合準(zhǔn)備，之后沿鎖骨正中線做2 cm縱向切口切開皮膚，在第四或第五肋間將大鼠胸部肌肉進(jìn)行鈍性分離，使胸骨、肋骨充分暴露，將胸腔打開，心包剪開，在胸廓輕輕按壓以將大鼠心臟擠出。使用無創(chuàng)性縫合線在動(dòng)脈圓錐與左心耳之間冠狀靜脈處進(jìn)行冠狀動(dòng)脈的結(jié)扎，之后將心臟迅速放回原位，將胸腔氣體擠出，并迅速將縫合線拉緊，將胸腔逐層進(jìn)行關(guān)閉，將外皮縫合好，保證開胸時(shí)間＜60 s。

對(duì)于假手術(shù)組大鼠，無創(chuàng)性縫合線穿過左冠狀動(dòng)脈，但不結(jié)扎，其余操作方法同上。

造模成功：結(jié)扎部位下的心肌顏色發(fā)白，心肌搏動(dòng)明顯減弱，心電圖ST段弓背抬高幅度明顯。

2.1.4 指標(biāo)檢測(cè)

從造模成功的大數(shù)中選取雌鼠、雄鼠各24只，每組包括雌鼠、雄鼠各4只。造模成功24 h后向大鼠腹腔注射20%烏來糖注射液進(jìn)行麻醉，劑量為1 ml/100 g。使用無菌注射器在大鼠腹主動(dòng)脈末端采集5 mL血液標(biāo)本，在4℃以下條件下進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為3000 r/min，時(shí)間為10 min，之后取上清液，在-80℃條件下進(jìn)行保存。

2.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以“x±s”表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

苦心丸對(duì)心肌缺血模型大鼠心肌糖代謝基因Akt、GLUt4蛋白水平表達(dá)的影響。檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組比較，苦心丸中劑量組和低劑量組動(dòng)物血清AKT蛋白含量高于模型組，苦心丸高、中、低劑量組動(dòng)物GLUt4蛋白水平均高于模型組。見表1。結(jié)果表明苦心丸可以促進(jìn)心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ虯kt和GLUt4蛋白的表達(dá)。對(duì)于抑制損傷心肌細(xì)胞凋亡和對(duì)缺血心肌損傷有一定的保護(hù)作用。

表1 苦心丸對(duì)心肌缺血模型大鼠Akt、GLUt4蛋白水平表達(dá)的影響（x±s）

3 討 論

要想保持心臟功能正常運(yùn)行，需要足夠的氧及氧化產(chǎn)物產(chǎn)生腺苷三磷酸（ATP），其中又以長(zhǎng)鏈脂肪酸作為主要供能來源。在心肌缺血缺氧的情況下，直接影響到心肌代謝功能，葡萄糖代謝則在心肌供能中扮演重要角色，葡萄糖從細(xì)胞外進(jìn)入細(xì)胞需要糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白協(xié)助運(yùn)輸，糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的載體，Akt和Glut4在糖代謝活動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要調(diào)節(jié)作用。

GLUt4主要分布在細(xì)胞內(nèi)，通常不參與葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，但是心肌缺血缺氧情況下，受到胰島素刺激作用，可以使GLUt4到細(xì)胞膜上幫助葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，而GLUt4的易位又與Akt/PKB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)聯(lián)。Akt的生物作用很多，例如促進(jìn)蛋白合成、減少細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)心肌收縮功能等。研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定的野型PKB過度表達(dá)大鼠能夠提高Glut4水平，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能，Akt活化能夠有效保護(hù)缺血心肌。心肌缺血缺氧，收縮功能降低時(shí)，磷酸化Akt和Glut4表達(dá)的增強(qiáng)幅度顯著，提示缺血后心肌的Akt和Glut4對(duì)于糖代謝有調(diào)節(jié)作用。因此缺血心肌糖代謝基因Akt、GLUt4 的蛋白水平表達(dá)研究對(duì)于闡明苦心丸中抗心肌缺血有效成分的作用機(jī)理有重要意義。