馮 峰, 李偉明, 孫 燕,3, 張 峰*

(1. 中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所, 北京 100176; 2. 番禺出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務中心實驗室, 廣東 廣州 511400; 3. 北京中醫(yī)藥大學, 北京 100029)

甜菊糖苷是從菊科草本植物甜葉菊葉中提取的高甜度、低熱量的天然甜味劑,被譽為繼甘蔗糖、甜菜糖之后的“第三代健康糖源”[1]。由于其甜度是蔗糖的200～350倍,且屬于天然來源,因此,目前越來越多的食品中加入甜菊糖苷以吸引消費者。研究表明,如果長期過量食用甜味劑,會對身體帶來較大傷害。我國《食品添加劑使用標準》(GB 2760-2014)中明確規(guī)定蒸餾酒中不允許添加甜味劑,配制酒和飲料中的甜味劑的使用也不得超過限量[2]。然而,一些企業(yè)為了逃避監(jiān)管,在白酒和飲料中添加甜味劑的情況仍時有發(fā)生。

目前,對于食品中甜味劑的檢測,文獻報道的大多還是針對人工合成甜味劑的檢測,主要有毛細管電泳法[3,4]、液相色譜法[5-8]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-15]等。天然甜味劑則因異構(gòu)體多,成分復雜,目前研究的還較少。范廣宇等[13]報道了一種使用親水作用色譜-液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜同時檢測人工和天然甜味劑的方法,但這種方法只能針對特定的甜味劑使用標準品進行檢測,無法對不斷出現(xiàn)的新合成甜味劑進行快速精準篩查和回顧性分析。

本研究建立了一種基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜進行白酒和飲料中甜菊糖苷類甜味劑非靶標的篩查方法,該方法不僅可以實現(xiàn)8種甜菊糖苷類甜味劑的精準定量,而且基于篩選出的甜菊糖苷類化合物的標識性碎片離子,還可以對樣品中未知甜菊糖苷進行非靶標篩查。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Q-Exactive四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)及Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司);分析天平XP 105(瑞士Mettler公司); Milli-Q Advantage A10超純水機(美國Millipore公司)。

甜菊苷(stevioside)、瑞鮑迪苷B(rebaudioside B)、瑞鮑迪苷D(rebaudioside D)、瑞鮑迪苷F(rebaudioside F)和杜克苷A(dulcoside A)購自美國ChromaDex公司;瑞鮑迪苷A(rebaudioside A)、瑞鮑迪苷C(rebaudioside C)和甜菊雙糖苷(steviolbioside)購自北京百靈威公司;以上化合物純度均大于97%。乙腈(色譜純)和甲酸銨(優(yōu)級純)購自美國Fisher公司。白酒和飲料樣品購自超市和電商平臺。

1.2 溶液制備

標準儲備液:準確稱取適量標準品,分別用水溶解,配制成1 000 mg/L的儲備液,于4 ℃儲存。

混合標準溶液:分別取8種甜菊糖苷的儲備液,用乙腈-水(65∶35, v/v)配制成10 mg/L的混合標準溶液,于4 ℃儲存,使用時根據(jù)需要用水或空白白酒樣品稀釋到所需濃度。

1.3 樣品制備

對于白酒樣品,準確稱取1.0 g樣品,用流動相進行5～10倍稀釋后,過0.22 μm有機濾膜后上機測定。對于飲料樣品,準確稱取1.0 g樣品,直接過0.22 μm水相濾膜后上機測定。

1.4 色譜條件

色譜柱:Waters XBridge Amide色譜柱(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm);柱溫:35 ℃。流動相:乙腈-10 mmol/L甲酸銨(65∶35, v/v);流速:0.4 mL/min。進樣體積:5 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

加熱電噴霧離子源(HESI),負離子模式;噴霧電壓:-3.0 kV;毛細管溫度:320 ℃;加熱器溫度:50 ℃;鞘氣:氮氣,流速為40 arb;輔助氣:氮氣,流速為5 arb;掃描模式:一級母離子全掃描和數(shù)據(jù)依賴的二級子離子掃描(full MS/dd-MS2)模式。一級母離子全掃描分辨率:7×104半高峰寬(FWHM);最大注 入時間:200ms;采集范圍:m/z150～1 200。數(shù)據(jù)依賴二級子離子掃描分辨率:1.75×104FWHM;觸發(fā)閾值:1×105;最大注入時間:50 ms。8種天然甜味劑的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表 1 8種甜菊糖苷的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of the eight steviol glycosides

圖 1 8種甜菊糖苷的超高效液相色譜-四極桿/靜電場 軌道阱質(zhì)譜提取離子色譜圖Fig. 1 Extract ion chromatograms of the eight steviol glycosides using ultra high performance liquid chromatography-quadrurpole/Orbitrap mass spectrometry

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

本研究采用Q Exactive高分辨質(zhì)譜的full MS/dd-MS2模式進行甜菊糖苷類化合物的分析,通過使用目標化合物的精確分子離子質(zhì)量數(shù),結(jié)合二級碎片離子譜的分析,可以實現(xiàn)在沒有標準品的情況下,對樣品中有無甜菊糖苷類化合物進行精準鑒定。設(shè)定母離子的掃描范圍為m/z150～1 200,不僅涵蓋目前能夠獲得的8種甜菊糖苷類標準品的質(zhì)量范圍,而且覆蓋到了絕大多數(shù)甜菊糖苷類化合物的相對分子質(zhì)量范圍,可以對未知的甜菊糖苷類化合物實現(xiàn)非靶標的篩查。在實際掃描過程中,當一級全掃描發(fā)現(xiàn)目標列表里的分子離子且信號強度超過預設(shè)值后,就會觸發(fā)數(shù)據(jù)依賴子離子掃描模式,進而獲得對應分子離子精確質(zhì)量數(shù)的二級離子全掃描質(zhì)譜信息,以實現(xiàn)定性確證。使用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜對實驗室已有的8種甜菊糖苷類化合物進行分析,色譜圖見圖1。

2.2 靈敏度、準確度和精密度

本研究也比較了使用四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜對目前可以通過商業(yè)化的方式購得的甜菊糖苷類化合物純品進行母離子定量、子離子定量以及樣品基質(zhì)定量結(jié)果的影響。結(jié)果表明,8種甜菊糖苷使用母離子定量時的線性關(guān)系要優(yōu)于子離子定量的線性關(guān)系,在使用母離子定量時,8種甜菊糖苷標準溶液在10～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)r2≥0.995)。

過在沒有經(jīng)過稀釋的白酒和飲料中準確加入一定量的混合標準溶液,配制成50 μg/L的加標樣品,進行回收率分析,以考察基質(zhì)效應。結(jié)果表明,對于飲料樣品,基質(zhì)干擾較少,回收率大于95%,但是白酒樣品特別是醬香型白酒樣品受樣品基體的影響比較大,回收率低于60%(40%～60%)。

為消除白酒基質(zhì)對甜菊糖苷類化合物定量的干擾,本研究采用基質(zhì)匹配標準曲線的方法進行校正,分別考察了未稀釋、稀釋5倍、稀釋10倍后白酒樣品加標繪制標準曲線的線性關(guān)系。結(jié)果表明,未稀釋白酒樣品部分化合物在10～1 000 μg/L范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)小于0.99,稀釋5倍或是10倍后的白酒樣品相關(guān)系數(shù)均大于0.995。考慮到稀釋倍數(shù)會影響方法的檢出限,最終選擇稀釋5倍的白酒作基質(zhì)匹配標準曲線,在此條件下測得的線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表2。逐級稀釋標準品,并對有信號檢出的最低濃度加標樣品重復進樣3次,用3次響應的信噪比(S/N)均大于3和10來確定檢出限和定量限,結(jié)果見表2。

回收率的檢測為在白酒樣品中準確加入一定量的混合標準溶液,用流動相稀釋5倍,配制成4個水平(50、100、250、500 μg/kg)的加標樣品,每個水平進行3次平行分析。8種甜味劑在線性范圍內(nèi)的平均加標回收率為81.9%～106%, RSD<10%,精密度良好(見表3)。

表 2 8種甜菊糖苷的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs of the eight steviol glycosides

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

表 3 白酒中8種甜菊糖苷的加標回收率和相對標準偏差(n=3)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the eight steviol glycosides in wines (n=3)

-: not detected.

圖 2 4種典型甜菊苷類化合物的二級碎片離子譜Fig. 2 Secondary fragment ion spectra of the four typical steviol glycoside compounds

2.3 甜菊糖苷類化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律

如Molina-Calle[12,14]所報道,甜菊糖苷類甜味劑屬于四環(huán)二萜糖苷,這類甜味劑的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)為內(nèi)-貝殼杉烯酸(ent-kaurenoic acid)經(jīng)羥基化后生成的甜菊醇,分子式為C20H30O3,精確相對分子質(zhì)量為318.219 5。在甜菊醇的C-19和C-13兩個不同位置的碳上接上不同數(shù)量的葡萄糖基、木糖基和鼠李糖基,就形成各種不同的甜菊糖苷類甜味劑[15]。據(jù)文獻[14]報道,目前從甜葉菊中分離純化的甜菊糖苷類甜味劑達30種以上,這些甜味劑由于缺乏標準品,無法通過傳統(tǒng)的方法得到識別和檢測?；趶母叻直尜|(zhì)譜獲取的8種甜菊糖苷類化合物的二級碎片離子精確質(zhì)量數(shù)信息(見表4和圖2),對甜菊糖苷類化合物的裂解規(guī)律進行了分析。從表4可以看出,甜菊糖苷類化合物的二級碎片離子質(zhì)譜圖中存在m/z479.265 0和317.211 9兩個共性特征碎片離子,根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)可以推斷,m/z317.211 9為甜菊醇分子離子峰,m/z479.265 0則是內(nèi)-貝殼杉烯-葡萄糖碎片離子。其余二級碎片離子則是內(nèi)-貝殼杉烯-葡萄糖基結(jié)合了別的單糖(包括葡萄糖基、鼠李糖基和木糖基,m/z641.316 3、625.322 1和611.306 4)而構(gòu)成。對比各種甜菊糖苷類化合物的二級碎片離子可以看出,對于甜菊醇的C-19和C-13兩個糖苷化位點來說,由于所有化合物在二級碎片離子譜中均看不到單獨丟失鼠李糖基和木糖基的碎片離子,所以可推斷C-19位更容易發(fā)生裂解,最終推斷出甜菊糖苷類化合物的裂解規(guī)律見圖3。

2.4 實際樣品測定

采集北京地區(qū)市售的7份飲料樣品和5份白酒樣品進行檢測。白酒樣品中未檢出甜味劑,飲料樣品中檢出4種天然甜味劑(甜菊苷、甜菊雙糖苷、瑞鮑迪苷A和瑞鮑迪苷C),含量未超過國家限量標準。此外,使用full MS/dd-MS2模式對于未有甜味劑檢出的白酒樣品中所有化合物進行碰撞裂解和二級碎片離子全掃描,并使用本研究發(fā)現(xiàn)的m/z479.265 0和317.211 9標識性碎片離子進行提取,未見到明顯色譜峰。

表 4 8種甜菊糖苷的化學結(jié)構(gòu)及二級碎片離子精確質(zhì)量數(shù)Table 4 Chemical structures and accurate masses of secondary fragment ions of the eight steviol glycosides

R1: functional group at C-19 unit; R2: functional group at C-13 unit; Nos. 1-20: serial number of carbon unit in steviol glycosides. Glc: glucose (-C6H11O6); Rha: rhamnose (-C6H11O5); Xyl: xylose (-C5H9O5).

圖 3 甜菊糖苷類化合物質(zhì)譜裂解途徑Fig. 3 Mass spectrometry fragment pathways of steviol glycoside compounds dR1: disrupt R1 functional group; dR2: disrupt R2 functional group; dGlc: disrupt glucose functional group.

3 結(jié)論

采用親水作用液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù),建立了食品中甜菊糖苷類甜味劑快速精準篩查方法,與目前所報道的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相比,本方法不僅靈敏度同樣滿足標準要求,而且不需要標準品即可對樣品中是否有菊糖苷進行快速和精準定性。同時,通過研究甜菊糖苷類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律,鑒定出2個甜菊糖苷類化合物的標識性碎片離子,實現(xiàn)了食品中未知甜菊糖苷類化合物的非靶標篩查。