發(fā)酵法生產(chǎn)納豆激酶的研究進展

文 雯 ，周 博，胡莉娟

（1.楊凌職業(yè)技術(shù)學院藥物與化工分院，陜西楊凌 712100；2.中國藥科大學，江蘇南京 211198）

納豆激酶（Nattokinase，NK） 最初是由日本心腦血管專家須見洋行教授從納豆發(fā)酵過程中提取得到的一種堿性絲氨酸蛋白酶[1]。研究表明，納豆激酶溶血栓能力強，可通過直接和間接雙重作用來持續(xù)發(fā)揮其纖溶活性[2-3]。通過體外溶栓試驗發(fā)現(xiàn)納豆激酶可以很好地溶解纖維蛋白凝塊[4]，體內(nèi)大鼠靜脈注射納豆激酶試驗表明納豆激酶纖溶活性是血纖維蛋白溶酶的4倍以上[5]。也有研究表明，健康人口服納豆激酶可以縮短優(yōu)球蛋白溶解時間[6]。目前，納豆激酶主要通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，主要對發(fā)酵法生產(chǎn)納豆激酶過程中菌種選育和發(fā)酵工藝2個方面進行總結(jié)，以期為納豆激酶生產(chǎn)提供參考。

1 菌種選育

作為微生物工業(yè)化發(fā)酵三大技術(shù)領(lǐng)域之一的菌種選育，在微生物藥物的發(fā)酵生產(chǎn)中有著至關(guān)重要的地位。當前，發(fā)酵工業(yè)中使用的生產(chǎn)菌株，大部分都是通過不同的育種技術(shù)而得到的具有高產(chǎn)目的產(chǎn)物的菌株。

1.1 傳統(tǒng)誘變劑誘變

使用傳統(tǒng)的物理誘變劑和化學誘變劑處理均勻分散的菌懸液，通過物理輻射和化學試劑能與D NA相互作用的特點實現(xiàn)對菌種遺傳物質(zhì)的改變，進而篩選出少數(shù)優(yōu)良性狀的突變株。

1.1.1 紫外誘變

紫外線是使用最廣泛的物理誘變劑，當它照射微生物細胞時，會導致微生物D NA分子形成嘧啶二聚體，進而可能引起菌株突變或死亡。薛健等人[7]利用20 W紫外燈照射納豆激酶生產(chǎn)菌90 s，獲得了1株產(chǎn)納豆激酶酶活達498.84 IU/mL菌株，比原始菌株提高了6.78%。王雅君等人[8]使菌懸液在距離紫外燈28～30 cm的位置，最佳照射時間為60 s時，經(jīng)過初篩和復篩得到正突變納豆芽孢桿菌U49，其產(chǎn)納豆激酶酶活為1 329.62 IU/mL，比出發(fā)菌株Z1提高了100.34%。余功保等人[9]采用紫外誘變成功篩選出了BSN-3菌株，該菌株的酶活比原始菌株酶活提高了258%。

1.1.2 亞硝基胍誘變

具有超誘變劑之稱的亞硝基胍（NTG）是一種烷化劑，在處理放線菌、細菌等微生物時，能使它們的細胞發(fā)生連續(xù)突變，不經(jīng)淘汰就可以直接得到10%以上的營養(yǎng)缺陷型突變株。沙維[10]采用0.3 mg/mL亞硝基胍對T-3納豆桿菌處理20 min，誘變2輪，篩選得到突變株Y2-1菌株，其產(chǎn)納豆激酶活力比原始菌株提高14.8%，達到5 740 IU/mL。

1.1.3 硫酸二乙酯誘變

硫酸二乙酯（D ES）也屬于烷化劑的一種，是一種常見的化學誘變劑。許建平等人[11]對枯草桿菌B826進行硫酸二乙酯處理，并篩選得到高效穩(wěn)定的突變株。

1.2 新型誘變劑誘變

近年來，在誘變育種方面除了經(jīng)常使用的傳統(tǒng)的誘變劑以外，還開發(fā)出一些新型的誘變劑，比如微波、超聲波、激光、離子注入和高能電子流等，它們在誘變育種中取得了較好的效果。下面介紹幾種納豆激酶生產(chǎn)菌株使用過的新型誘變劑。

1.2.1 微波誘變

微波是近年來發(fā)展較快的新型物理誘變劑，研究表明一定頻率的微波會干擾細胞內(nèi)D NA分子氫鍵和堿基堆積力，進而對微生物產(chǎn)生一定的致死能力和誘變效應[12]。沙維[10]用380 W微波在加熱累計時間40 s的條件下，經(jīng)過2輪誘變篩選得到突變株W2-1，其發(fā)酵得到的納豆激酶酶活為5 450 IU/mL，比原始株提高9%。王雅君等人[8]對納豆芽孢桿菌Z1采用微波誘變，經(jīng)過篩選得到突變株W51，其相對納豆激酶活力為735.19 IU/mL。

1.2.2 離子注入誘變

離子注入是20世紀80年代初興起的一種處理材料表面的高新技術(shù)，所謂離子注入誘變，就是利用低能離子注入生物體引起遺傳物質(zhì)改變，造成性狀變異，達到育種目的方法[13-14]。這種誘變方法具有方向性和可控性，高宏[15]將30×2.6×1 013～200×2.6×1 013 ion/cm2N+注入枯草芽孢桿菌，最終得到穩(wěn)定遺傳突變株，酶活比原始菌株提高了160%。

1.2.3 超聲波誘變

超聲波會導致微生物菌體細胞內(nèi)的空化作用，其產(chǎn)生的高溫和高壓在一定條件下可以使細胞具有突變的可能性。目前，利用超聲波誘變育種已有很多報道，超聲的功率、頻率和時間是超聲波誘變的關(guān)鍵因素。沙維[10]用70 kHz，220 W超聲波對原始菌株累積處理25 min，篩選獲得突變株C2-1菌株，其發(fā)酵生產(chǎn)的納豆激酶活力達到5 585.35 IU/mL，比原始菌株提高了11.7%。

1.2.460C o-γ射線誘變

60Co-γ射線是高能電磁波的一種，其可以產(chǎn)生較強的電離輻射，該輻射可作用于微生物細胞的遺傳物質(zhì)，發(fā)生染色體斷裂，從而引發(fā)基因結(jié)構(gòu)變化，致使微生物的突變。李淑英等人[16]用800 Gy的60Co-γ射線誘導納豆激酶生產(chǎn)菌，一共得到60株活性增加的菌株。古亞楠[17]用500 Gy60Co-γ射線誘變納豆菌菌株，正向突變率3.4%，并篩選得到1株酶活為2 040.54 IU/g的菌株。

1.3 復合誘變

復合誘變也稱聯(lián)合誘變，一般指先后使用2種或2種以上的誘變劑或者多種誘變劑同時使用。如果誘變劑合理搭配使用，則一般效果優(yōu)于單一的誘變，會產(chǎn)生協(xié)同效應。關(guān)志煒[18]通過物理誘變劑紫外線和化學誘變劑鹽酸羥胺進行復合誘變處理，采用利福平抗性平板和發(fā)酵相結(jié)合的篩選方法，獲得了突變株NU9012，其產(chǎn)酶能力提高了68%，達到648 IU/mL。蔡超靖等人[19]采用光敏試劑8-甲氧基補骨脂素和紫外誘變相結(jié)合，對根酶Rh23原生質(zhì)體進行復合誘變，得到了高產(chǎn)且發(fā)酵性能穩(wěn)定的突變株。桂麗等人[20]采用微波和紫外線復合誘變，最終篩選得到產(chǎn)納豆激酶活力為2 200 IU/g的突變株。

1.4 原生質(zhì)體技術(shù)育種

原生質(zhì)體對誘變劑的敏感性高于孢子或菌體細胞，將原生質(zhì)體再生與原生質(zhì)體誘變相結(jié)合，已經(jīng)成為微生物育種的重要手段。劉新梅等人[21]對納豆菌B.N.K菌株的原生質(zhì)體再生育種，試驗結(jié)果表明，直接再生發(fā)生了正突變，提高了納豆激酶酶活力，并且發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體直接再生菌株雖可產(chǎn)生變異，但變異幅度較原生質(zhì)體經(jīng)紫外誘變要小。試驗采用原生質(zhì)體技術(shù)和紫外誘變聯(lián)合技術(shù)最終獲得產(chǎn)納豆激酶酶活較高的菌株U V103，U V212。

1.5 基因工程技術(shù)育種

雖然工業(yè)生產(chǎn)中使用的高產(chǎn)菌株大多是通過物理或化學手段進行誘變育種得到的，但是隨著時代的進步，傳統(tǒng)誘變方法的誘變盲目性、篩選工作量大、遺傳不穩(wěn)定等缺點越來越凸顯。越來越多的人利用基因工程育種技術(shù)對原始菌株進行有目的、定向的改造，并取得了顯著的成效。W ei X等人[22]利用P CR基因擴增技術(shù)篩選出1株納豆激酶高產(chǎn)菌株。趙菡等人[23]通過對遠離酶活性中心的Asn和Gln位點進行突變體構(gòu)建，最后篩選得到突變體Q59E，催化活性顯著提高。Y ongjun C等人[24]利用D NA shuffling技術(shù)篩選得到納豆菌產(chǎn)納豆激酶活力提高了2.3倍。Y ou L等人[25]采用連續(xù)循環(huán)易錯P CR技術(shù)在枯草桿菌蛋白酶E中引入隨機突變并篩選突變文庫，獲得活力提高的突變體。

2 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

為了提高納豆激酶的活力，除了菌種選育以外，還需要對發(fā)酵過程中各種參數(shù)條件進行試驗設(shè)計考查。

2.1 液體發(fā)酵

液體發(fā)酵主要指借助于液體介質(zhì)來完成的發(fā)酵。此種發(fā)酵方式成本低廉、菌體生長快速、發(fā)酵周期短、可以進行大規(guī)模生產(chǎn)。目前，我國許多科研院所都對納豆激酶的液體發(fā)酵工藝條件進行了研究。梁劍光[26]通過研究發(fā)現(xiàn)當碳源為可溶性淀粉、氮源為大豆蛋白胨時，最終酶活提高2倍。古亞楠[17]通過對培養(yǎng)基內(nèi)的碳、氮源優(yōu)化，產(chǎn)納豆激酶活力較之前提高了19.5 IU/mL。Kwon E Y等人[27]采用高密度分批補料使納豆激酶活力高達14 500 U/mL。田艷[28]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵12 h時添加0.1%的油酸鈉有助于酶的分泌。

目前液體發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的工藝中，常見使用的氮源是大豆蛋白胨、蛋白胨和豆粕粉等，常用碳源有可溶性淀粉、木糖和玉米淀粉等。除此以外，培養(yǎng)基組成一般還含有磷酸鹽。根據(jù)納豆激酶屬于初級代謝產(chǎn)物的特點，產(chǎn)酶階段集中在微生物生長對數(shù)期后期和穩(wěn)定期前期，故發(fā)酵周期不應過長。納豆激酶多為耗氧菌產(chǎn)生，故發(fā)酵過程中需氧量較大，發(fā)酵轉(zhuǎn)速不能過低。

2.2 固體發(fā)酵

固體發(fā)酵是指微生物在沒有或基本沒有游離水的固態(tài)機制上的發(fā)酵方式。目前也有大量研究者采用該方式進行納豆激酶的發(fā)酵，常用的基質(zhì)為蒸煮過的黃豆，通過考查不同培養(yǎng)條件對納豆激酶的影響。黃婷[29]以黃豆為基質(zhì)，采用初始含水量51%，接種量0.15%，在43℃下固體發(fā)酵24 h，得到的納豆激酶含量達0.076 mg/mL。路龍女等人[30]以破碎大豆為基質(zhì)，接種量8%，發(fā)酵24 h，納豆激酶活力最高達976 IU/g。張杰等人[31]采用破碎度為四瓣，在90℃下烘炒5 min的黃豆進行固體發(fā)酵，添加3%的魔芋精粉，接種量8%，在37℃下發(fā)酵1 d，得到的納豆激酶酶活為3 582.48±83.13 U/g。李永飛等人[32]研究了蔗糖、葡萄糖和谷氨酸鈉3種物質(zhì)對固體發(fā)酵納豆激酶的影響，發(fā)現(xiàn)添加蔗糖和谷氨酸鈉有助于提高產(chǎn)酶，而添加葡萄糖反而抑制。

目前，納豆激酶固體發(fā)酵的原材料不斷改進，以黃豆為基礎(chǔ)，開發(fā)了鷹嘴豆、蕓豆、麩皮等新的固體發(fā)酵基質(zhì)，并且不斷優(yōu)化發(fā)酵條件，力求在納豆激酶的生產(chǎn)過程中不斷創(chuàng)新。

3 結(jié)語

伴隨著人口老齡化問題日益嚴重，心腦血管疾病尤其是血栓病已經(jīng)成為威脅人類的頭號殺手，而溶栓是治療該類疾病的重要手段。目前，臨床上的溶栓藥物主要有尿激酶、鏈激酶和纖溶酶原激活因子，但在一定程度上均存在副作用大、成本高、在體內(nèi)半衰期短等缺陷，納豆激酶在這些方面正好彌補了這些不足。除了溶栓作用，納豆激酶還有輔助降血壓、降血脂等功效。但是，納豆激酶產(chǎn)率不高一直是限制其進一步開發(fā)的重要原因。目前，納豆激酶大多通過發(fā)酵法制得，無論其產(chǎn)生菌的菌種選育還是發(fā)酵工藝優(yōu)化都對納豆激酶的產(chǎn)量起著重大影響。利用基因工程技術(shù)、多種育種方法相結(jié)合，優(yōu)化發(fā)酵工藝，進一步探究納豆激酶發(fā)酵過程機理，提高納豆激酶產(chǎn)率，開發(fā)出更多滿足人們需求的新產(chǎn)品，具有廣闊的前景。