不同移植途徑下小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞向肝臟遷移情況比較

穆麗雅 唐秀芬 孫媛媛

終末期肝病的治療仍是臨床的棘手問(wèn)題, 隨著干細(xì)胞研究的深入, 為肝病臨床治療方法上開(kāi)辟了一條新路。13年前,自體骨髓干細(xì)胞移植已應(yīng)用于臨床治療失代償期肝硬化, 患者的臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢查均得以改善［1］, 相繼大量文獻(xiàn)報(bào)道［2］, 骨髓干細(xì)胞移植治療失代償期肝硬化均取得較好的治療效果。失代償期肝硬化肝功衰竭的病理原因是肝臟結(jié)構(gòu)的改變, 移植的骨髓干細(xì)胞可以分化為正常的肝細(xì)胞, 若是選擇時(shí)間恰當(dāng), 可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化, 骨髓干細(xì)胞可以分化為功能完備的肝細(xì)胞, 受損的肝組織對(duì)干細(xì)胞向肝臟遷移具有定向作用, 基于大量的體內(nèi)外干細(xì)胞的研究, 自體骨髓干細(xì)胞移植已應(yīng)用于臨床, 并獲得了很好的治療效果, 為等待肝臟移植的患者贏取了更多的等待時(shí)間, 同時(shí)也能為終末期肝病患者緩解臨床癥狀, 提高生活質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料 選取雄性BALB/c小鼠80只, 體質(zhì)量18～22 g,購(gòu)買和飼養(yǎng)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?, CCL4(哈爾濱市鑫鵬化學(xué)試劑廠), 2-乙酰氨基芴(2-Acetamidofluorene,Fluka Biochemika), 紅色熒光染料PKH26(Sigma公司), 聚乙二醇-400(天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司), DMEM(dubecco’s modifided eagle’s medium, DMEM)培養(yǎng)基及胎牛血清(Invitrogen公司)。將小鼠隨機(jī)分為移植組(A組、B組、C組、D組, 每組10只)和供體組40只。

1.2 方法

1.2.1 將溶于聚乙二醇的2-乙酰氨基芴按20 mg/kg 灌胃(ig)共7 d, 8 d行腹腔注射(ip)1 g/LCCL4橄欖油溶液20 ml/kg, 9 d行骨髓移植, 10 d起2-乙酰氨基芴20 mg/kg 腹腔注射共7 d,制備肝損傷模型。

1.2.2 無(wú)菌手術(shù)取出供體組小鼠的雙側(cè)股骨, 用肝素生理鹽水沖出骨髓, 再經(jīng)過(guò)7→5號(hào)針頭后, 3000 r/min離心5 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸, 然后用淋巴細(xì)胞分離液分離, 吸取界面上灰白色細(xì)胞, 用PBS洗2遍, 得骨髓單核細(xì)胞, 采用4 μmol/L PKH26標(biāo)記所分離出來(lái)的骨髓單核細(xì)胞, 骨髓干細(xì)胞體外標(biāo)記方法按說(shuō)明書操作, 骨髓干細(xì)胞移植：①臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)檢驗(yàn)細(xì)胞活性, 均達(dá)到95%以上, 可用于細(xì)胞移植；②A組小鼠用10 g/L戊巴比妥鈉以50 mg/kg麻醉后, 取腹部正中切口, 經(jīng)門靜脈穿刺注射骨髓單核細(xì)胞懸液0.3 ml,并用11-0無(wú)損傷縫合線縫合裂口, 同時(shí)腹腔注射1萬(wàn)U青霉素, 然后關(guān)閉腹腔。B組小鼠經(jīng)尾靜脈注入骨髓單核細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)均為3×10/只)0.3 ml。C組小鼠采用碘伏消毒右下腹部皮膚, 腹腔注射骨髓單核細(xì)胞液0.3 ml。D組小鼠同A組小鼠, 麻醉后開(kāi)腹脾內(nèi)注射骨髓單核細(xì)胞液0.3 ml。

1.2.3 移植2周后處死小鼠, 取所有小鼠的最大肝葉組織,置液氮中速凍, 然后置-80℃冰箱中保存, 待制備等面積的肝組織冰凍切片。

1.3 觀察指標(biāo) 20倍鏡下, 將每張冰凍切片上的熒光標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相加, 計(jì)算其平均值, 并進(jìn)行組間比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

熒光染色組織學(xué)檢查 PKH26吸收551nm的綠色激發(fā)光后發(fā)出紅色熒光, 在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn), 各組小鼠肝組織切片中均可見(jiàn)散在的紅色熒光標(biāo)記, 多數(shù)分布在肝細(xì)胞索內(nèi), 提示體外PKH26標(biāo)記的骨髓細(xì)胞能夠移居肝臟。PKH26標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞在20倍鏡下每張切片總數(shù)平均值A(chǔ)組為(175.46±20.32)個(gè), B組為(172.92±19.45)個(gè), C組為(169.37±18.28)個(gè), D組為(170.89±23.27)個(gè);各組遷移的細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

經(jīng)過(guò)大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明［3］, 骨髓干細(xì)胞可以分化為功能完備的肝細(xì)胞, 受損的肝組織對(duì)干細(xì)胞向肝臟遷移具有定向作用, 基于大量的體內(nèi)外干細(xì)胞的研究, 自體骨髓干細(xì)胞移植已應(yīng)用于臨床, 并獲得了很好的治療效果, 為等待肝臟移植的患者贏取了更多的等待時(shí)間, 同時(shí)也能緩解終末期肝病患者的臨床癥狀, 提高患者的生活質(zhì)量。

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)四種移植途徑進(jìn)行對(duì)比研究, 這四種途徑均是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)常用的移植途徑。PKH26是骨髓干細(xì)胞研究中常用的標(biāo)記物, 其染色快, 穩(wěn)定性高, 活體細(xì)胞無(wú)毒性, 細(xì)胞分裂后標(biāo)記物也會(huì)分裂, 熒光衰減的速度降低。本次實(shí)驗(yàn)中, 通過(guò)遺傳相似性可以發(fā)現(xiàn), 自體骨髓移植防止了細(xì)胞移植出現(xiàn)的排斥免疫問(wèn)題［4,5］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 熒光染色組織學(xué)檢查 PKH26吸收551nm的綠色激發(fā)光后發(fā)出紅色熒光,在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn), 各組小鼠肝組織切片中均可見(jiàn)散在的紅色熒光標(biāo)記, 多數(shù)分布在肝細(xì)胞索內(nèi), 提示體外PKH26標(biāo)記的骨髓細(xì)胞能夠移居肝臟。PKH26標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞在20倍鏡下每張切片總數(shù)平均值A(chǔ)組為(175.46±20.32)個(gè),B組為(172.92±19.45)個(gè), C組為(169.37±18.28)個(gè), D組為(170.89±23.27)個(gè);各組遷移的細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。由此說(shuō)明骨髓干細(xì)胞移植途徑可以選擇外周靜脈, 其經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單, 更易操作。

總之, 失代償期肝硬化肝功衰竭的病理原因是肝臟結(jié)構(gòu)的改變, 移植的骨髓干細(xì)胞可以分化為正常肝細(xì)胞, 若是選擇時(shí)間恰當(dāng)可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化, 但是是否可以改變假小葉結(jié)構(gòu)仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究得以明確。