李 潔，姚曉華

（青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院/青海省農(nóng)林科學(xué)院作物育種栽培研究所/青海省青稞遺傳育種重點實驗室/國家麥類改良中心青海青稞分中心，青海 西寧 810016）

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，作物在復(fù)雜的生長環(huán)境中受到各種不利于其生長發(fā)育的環(huán)境脅迫，如溫度、水分、離子以及各種病、蟲害等非生物和生物因素的脅迫，已成為制約其生長發(fā)育、影響產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵性因素［1-2］。為此，作物響應(yīng)外界脅迫時會通過體內(nèi)的生化物質(zhì)調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進一步調(diào)節(jié)其體內(nèi)相關(guān)抗逆基因的表達，以適應(yīng)外界不利的生長環(huán)境［3］，這是一個由多種信號通路所調(diào)節(jié)的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，單從某一方面研究都不能較為完整地探究其中機理。隨著具有更高完整性、更好連續(xù)性的水稻［4］、大麥［5］、小麥［6］、青稞［7］等全基因組序列的完成，目前，如何更加全面、整體地從不同層面研究作物所出現(xiàn)的基因轉(zhuǎn)錄、表達、翻譯、修飾以及生理代謝等問題是分子育種中較為關(guān)注的研究方向，同時也是解決單一組學(xué)研究瓶頸的又一有效方法。得益于日趨發(fā)展的測序技術(shù)及手段，以高通量、大規(guī)模、高靈敏度為特點的數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計方法開始大量應(yīng)用于作物脅迫的綜合性分析。組學(xué)（Omics）是基于高通量分析的系統(tǒng)生物學(xué)研究，按照分析目標的不同分為基因組學(xué)（Genomics）、轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Transcriptomics）、蛋白質(zhì)組學(xué)（Protemics） 、代謝組學(xué)（Metabolomics）［8］及離子組學(xué)（Ionomics）［9］等。不同組學(xué)分別從不同層面反映生物體內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄、表達、翻譯、修飾以及生理代謝等情況，其目的在于實現(xiàn)各種數(shù)據(jù)的互補，使研究者對生物體的表達信息有更加充分完整的理解。在對之前作物抗逆的研究發(fā)現(xiàn)，通過對作物抗逆過程的多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析，可提高鑒定參與相關(guān)活動的關(guān)鍵功能基因的準確性，同時更加精確闡釋關(guān)鍵功能基因的表達模式及其參與通路，同時這種分析方法也可運用于對轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物進行無偏倚的安全性評價中［10］。目前在文獻中可以查到，對各類作物抗逆研究運用較多的為2～3種組學(xué)或更多種組學(xué)的綜合運用模式。通過進一步實踐和探討如何有效選擇組學(xué)整合策略，為研究者綜合運用多組學(xué)去從整體層面探究作物在響應(yīng)逆境脅迫以及輔助育種提供一定的參考。

1 組學(xué)概述

基因組學(xué)是一門研究生物基因組以及如何利用基因的學(xué)科，用于概括涉及基因作圖、基因測序以及對整個基因組功能進行分析的遺傳學(xué)分支［11］?；蚪M學(xué)按其研究內(nèi)容又可分為功能基因組學(xué)（Functional genomics）、結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（Sstructural genomics）和比較基因組學(xué)（Comparative genomics） 等［12］。目前較為通用的研究方法為高通量測序技術(shù)對某一作物進行測序及重測序。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一門在整體水平上研究細胞中基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科［13］，即研究特定組織或細胞在某一發(fā)育階段或特定狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，主要為編碼蛋白RNA（mRNA）和非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）［14］，目前廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析常用的技術(shù)分為3類，包括基于標簽的技術(shù)〔如基因表達序列分析（SAGE）技術(shù)〕、基于雜交的技術(shù)〔如DNA微陣列（DNA microarray）〕以及基于直接測序技術(shù)〔如轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）〕等，近年來高通量測序以其高通量、高靈敏度、高準確性和低運營成本優(yōu)勢逐漸成為該領(lǐng)域的主流研究方法。

蛋白質(zhì)組學(xué)是對細胞、組織或生物體某一時期蛋白質(zhì)組成成分及含量變化規(guī)律的學(xué)科，最早在1994年由MARC WIKINS提出。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是揭示生物生命現(xiàn)象的重要手段之一，隨著技術(shù)的成熟，其較多地應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中［15］。蛋白質(zhì)組學(xué)又可分為表達蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)、功能蛋白質(zhì)組學(xué)、差異蛋白質(zhì)組學(xué)、相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)、亞細胞蛋白質(zhì)組學(xué)、定量蛋白質(zhì)組學(xué)等［16］。目前較為成熟的蛋白質(zhì)定量研究技術(shù)可分為傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳技術(shù)（2DE）、質(zhì)譜檢測技術(shù)（MS）、蛋白芯片技術(shù)（ Protein chips）、酵母雙雜交技術(shù)（Yeast twohybrid system）等。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，是研究在某一時刻生命體內(nèi)細胞所有代謝物集合的一門學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)研究的重要組成部分［17］。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分別從RNA和蛋白質(zhì)層面探尋生命的活動，代謝產(chǎn)物作為基因轉(zhuǎn)錄與蛋白修飾的最終產(chǎn)物，在細胞信號釋放、能量傳遞、細胞間通信等均發(fā)揮著極大的調(diào)控作用，其研究結(jié)果可揭示生物體受遺傳或環(huán)境因素影響后的變化規(guī)律，更接近生物的表型，因此被廣泛應(yīng)用于疾病診斷、醫(yī)藥研制開發(fā)、植物學(xué)等領(lǐng)域［18］。目前，代謝產(chǎn)物的分離鑒定技術(shù)主要有氣相色譜（GC） 、液相色譜（LC）、毛細管電泳（CE）、 質(zhì)譜聯(lián)用、核磁共振（NMR）等，分離技術(shù)與檢測技術(shù)的不同組合形成了不同的代謝組學(xué)分析技術(shù)［19］。

2 多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析研究

2.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)是以2個不同的分子層面反映生物體內(nèi)基因的表達情況，關(guān)聯(lián)分析的目的在于實現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)之間的對比與互補，更加深入了解生物體內(nèi)蛋白質(zhì)和基因表達的內(nèi)在關(guān)系，以揭示基因表達以及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控狀態(tài)，得到生物體更加完整的表達信息。因此，蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組間的關(guān)系是未來系統(tǒng)生物研究中非常重要的部分［20］。

杜春芳［21］對甘藍型油菜4 ℃低溫脅迫0～24 h的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組進行分析，發(fā)現(xiàn)具有相同趨勢的可關(guān)聯(lián)差異基因有177個，這些基因在不同低溫脅迫階段中其差異性是動態(tài)變化的，涉及催化活性、結(jié)合通路、代謝過程、細胞生理、刺激應(yīng)答通路中的關(guān)鍵基因。這些具有相同趨勢的關(guān)聯(lián)差異基因在次生物質(zhì)代謝、激素信號通路、植物-病原菌互作等通路明顯富集。XIN等［22］對小麥開花前熱啟動以及開花后高溫脅迫耐受的機制研究發(fā)現(xiàn)，在花前熱啟動和花后高溫脅迫的差異表達基因與蛋白分別為 962 和 167 個，對差異基因及蛋白的功能進行分析，發(fā)現(xiàn)編碼感受信號的基因上調(diào)，熱休克蛋白、氧化還原穩(wěn)態(tài)、編碼代謝的基因下調(diào)；花期前經(jīng)過熱啟動的植株與非啟動植株相比，在應(yīng)對花期后高溫脅迫時，上調(diào)和下調(diào)的基因及蛋白可對小麥的生長發(fā)育起到一定的保護作用，表明花前熱啟動可以啟動轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平的適應(yīng)反應(yīng)，從而提高小麥植株后期的耐熱性。這些結(jié)果對于理解未來氣候變化情景下熱脅迫對小麥產(chǎn)量的影響具有重要意義。曾維英等［23］以高抗材料趕泰-2-2和高感材料皖 82-178為研究對象，對大豆受豆卷葉螟幼蟲脅迫0 h和48 h的蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平進行分析，共關(guān)聯(lián)到34條通路以及300個差異表達蛋白（DEPs）和28個差異表達基因（DEGs），并鑒定出10個可能是大豆抗豆卷葉螟潛在的靶標蛋白（基因）。

KOH 等［24］對油菜（Brassica napusL.）在干旱脅迫下20個基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平進行比較發(fā)現(xiàn)，在每一個時間點，雖然在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平中觀察到不同表達模式，但轉(zhuǎn)錄及翻譯水平存在正相關(guān)關(guān)系。在干旱脅迫下，大多數(shù)蛋白質(zhì)豐富度變化的原因可能是由于基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，而蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTMS）對蛋白質(zhì)的多樣性和功能也同樣存在明顯貢獻。

在許多研究中也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中存在相關(guān)系數(shù)較低甚至出現(xiàn)負相關(guān)的情況，原因可能是檢測的時間點不同，其轉(zhuǎn)錄與翻譯不一致，導(dǎo)致mRNA水平和蛋白質(zhì)豐度之間有限對應(yīng)關(guān)系。與DNA轉(zhuǎn)錄形成mRNA以及后期翻譯成蛋白質(zhì)的過程中，受到體內(nèi)其他因子對該過程的一系列調(diào)控，有可能使mRNA數(shù)量以及蛋白質(zhì)數(shù)量、所在細胞器位置和功能發(fā)生變化［25］。因此，如何從轉(zhuǎn)錄組結(jié)合蛋白質(zhì)組分析時獲得的大量數(shù)據(jù)中挖掘出抗逆的關(guān)鍵基因就非常重要。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的聯(lián)合分析方法，是實現(xiàn)對基因及代謝物的全譜分析的實驗方法，兩種組學(xué)的組合可較為全面地同時實現(xiàn)從“因”至“果”兩個方向探究作物在耐逆境中的生物學(xué)問題，相互間的驗證作用更明顯。同時結(jié)合功能分析、代謝通路富集、分子互作等生物功能分析，系統(tǒng)全面地解析生物分子功能和調(diào)控機制之間的關(guān)聯(lián)性，最終實現(xiàn)對作物耐逆境分子功能和調(diào)控機制的理解，并篩選出重點代謝通路或者基因、代謝產(chǎn)物進行后續(xù)深入實驗分析與應(yīng)用。

在非生物脅迫方面，ZHANG等［26］以耐寒性差異顯著的亞洲栽培水稻（Oryza sativa）的兩個亞種日本晴和9311為材料，在6個時間點進行冷處理和冷處理后恢復(fù)的代謝組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理期間日本晴抗氧化相關(guān)化合物的積累比9311早，在恢復(fù)期日本晴中耐寒相關(guān)代謝物的誘導(dǎo)較冷敏感品種9311更為活躍，在9311中與衰老相關(guān)的化合物開始積累，但在日本晴中未發(fā)現(xiàn)；該試驗構(gòu)建了日本晴的低溫響應(yīng)以及恢復(fù)期的動態(tài)代謝模型，并揭示了ROS主導(dǎo)的水稻對低溫環(huán)境的適應(yīng)機制。WANG等［27］為了解水稻幼苗耐鹽生理和分子機制，以水稻鹽敏感株系IR64和耐鹽株系PL177為研究材料，對兩種基因型的水稻在鹽脅迫和鹽+脫落酸（ABA）脅迫下植株的表型、代謝和轉(zhuǎn)錄組反應(yīng)進行了研究，結(jié)果表明，在外源ABA存在下耐鹽株系PL177能選擇性降低根部Na+的積累，并將K+轉(zhuǎn)移至芽，可以更好地將鹽從根系中排除，并將鹽分隔在幼芽中，誘導(dǎo)許多初級代謝產(chǎn)物的增加，其中糖和脯氨酸在芽和根尿囊素中積累，并篩選出幾個耐鹽的水稻候選基因，為提高水稻的耐鹽育種提供理論參考依據(jù)。WANG等［28］研究了在磷缺乏和磷充足條件下生長的燕麥根系轉(zhuǎn)錄和代謝反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在磷缺失10 d后，鑒定出9 371個存在表達差異的轉(zhuǎn)錄本，其表達差異在2倍或2倍以上，磷酸化代謝物（葡萄糖-6-磷酸、肌醇磷酸鹽）顯著減少，檸檬酸鹽和蘋果酸鹽、部分糖和氨基酸略有增加。在缺磷28 d 后，燕麥根部檸檬酸鹽和蘋果酸鹽滲出增強，與在燕麥中磷缺乏對初級代謝影響中增加有機陰離子外排的策略相一致。CHEN等［29］利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合代謝組學(xué)和生理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，ROS介導(dǎo)的氧化還原信號在不同pH條件下影響細胞鐵的穩(wěn)定性以及水稻生長。比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，1 318個DEGs中有83%在pH 4時下調(diào)，1 168個DEGs中有73%在pH 8時上調(diào)。對pH調(diào)節(jié)細胞氧化還原過程和控制水稻生長的代謝途徑進行研究，闡明了極端pH對水稻生長和鐵穩(wěn)態(tài)的破壞性以及由此引起水稻的適應(yīng)性反應(yīng)，并確定其最佳生長pH值為6。

在生物脅迫方面，AGARRWAL等［30］利用轉(zhuǎn)錄組和代謝組對水稻和昆蟲相互作用進行分析，顯示耐藥宿主中分別有7 000多個差異表達基因和80多種差異代謝物。轉(zhuǎn)錄本和代謝譜的綜合結(jié)果首次為水稻對癭蚊的一種超敏陽性反應(yīng)所具有的抗性提供了佐證。DHOKANE等［31］對小麥禾本科鐮刀菌引起的鐮刀菌頭疫?。‵HB） QTLFhb2的耐藥和易感等位基因重組自交系進行代謝組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)4-香豆酸鹽：CoA連接酶等6個酶及轉(zhuǎn)錄因子為可能定位于QTLFhb2區(qū)域的候選抗性基因。在進一步功能鑒定和驗證后，這些抗性基因可以用于替代易感品系的非功能性基因，以提高小麥鐮刀菌頭疫抗性。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的聯(lián)合分析方法也可運用于轉(zhuǎn)基因作物與環(huán)境互作的評估中，WANG等［32］對含有cry1Ab/2Aj和G10-epsps基因的抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米12-5和含cry1Ie基因的抗蟲玉米IE034材料的雜交后代以及2個親本轉(zhuǎn)基因玉米和6個常規(guī)玉米品種的轉(zhuǎn)錄譜和代謝譜的差異進行了研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因玉米育種復(fù)合所帶來的基因表達和代謝物的變化數(shù)量介于常規(guī)玉米品種間的變異范圍之內(nèi)，該研究對評估轉(zhuǎn)基因作物的基因疊加效應(yīng)提供了科學(xué)依據(jù)。

2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)

由于植物激素是作物生長和發(fā)育的核心，在作物受到外界脅迫時其蛋白質(zhì)、代謝物發(fā)生變化較多，利用作物的蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究可以鑒定出許多與作物耐逆性物質(zhì)代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)和代謝物，從分子水平研究導(dǎo)致其變化的原因。

CHMIELEWSKA等［33］利用蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的手段對兩種基因型（敏感型、耐旱型）大麥在干旱脅迫下葉片和根系的變化進行研究，結(jié)果顯示，兩種基因型的葉片中有121種干旱響應(yīng)蛋白、根部有182種，許多已鑒定的干旱響應(yīng)蛋白都與水分虧缺期間功能受到嚴重影響的功能過程有關(guān)，包括光合作用和碳代謝；在葉片和根部較多數(shù)量的差異蛋白是由大麥植株防御機制所產(chǎn)生的，該研究同時發(fā)現(xiàn)干旱敏感型及耐受型大麥品系響應(yīng)水分虧缺的差異。黃宇［34］利用蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的手段以材料Taichuang29為對照對抗條銹病小麥近等基因系Taichung29×6/Yr10進行分析，發(fā)現(xiàn)在Tyr10中，SOD與Vitamin E在蛋白表達水平和代謝物積累水平中都發(fā)生了上調(diào)，其自由基清除能力都得到提高，表明TYr 10 的抗條銹病性能可能與其抗氧化能力的提高有較大關(guān)系。

蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的聯(lián)合還可運用于轉(zhuǎn)基因材料的安全性效應(yīng)檢測，郝文媛［35］對轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米在蛋白質(zhì)組水平和代謝組水平進行了不同轉(zhuǎn)基因材料與對照間的差異檢測，結(jié)果顯示在蛋白質(zhì)水平上未發(fā)生非預(yù)期效應(yīng)，但在代謝組有顯著差異，Z58（自交系）背景的轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米之間的差異要小于ZD958（雜交種）背景的玉米，表明相同遺傳背景下代謝組的差異可能由于外源基因插入受體基因組所導(dǎo)致，而不同背景下的差異可能是外源基因插入和受體遺傳背景差異（自交系和雜交種）的共同效應(yīng)。

2.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)

目前，在作物抗逆機制研究中常用的3種組學(xué)的聯(lián)合分析以轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)為主，研究轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)表達數(shù)據(jù)避免了單一組學(xué)結(jié)果的片面性和不準確性，獲得了更真實、更系統(tǒng)的分子變化信息，并通過兩個組學(xué)的聯(lián)合分析揭示了新的、不同的調(diào)控機制，通常代謝組學(xué)研究作為轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的互補，可以使整個研究作物的動態(tài)變化更加全面，并且實現(xiàn)了分子調(diào)控與表型變化有機統(tǒng)一。

BARROS等［36］利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)3種技術(shù)比較兩個轉(zhuǎn)基因玉米系與對照品種在不同環(huán)境中的表現(xiàn)，共監(jiān)測到10個基因、4種蛋白質(zhì)、20種代謝物在不同品種中存在差異表達，在不同年份種植中發(fā)現(xiàn)有10個基因、5種蛋白質(zhì)、43種代謝物存在差異表達，表明不同環(huán)境因素導(dǎo)致不同基因型玉米轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物的不同。曾建斌［37］利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)結(jié)合方法對野生大麥的耐低鉀機制進行初步研究，鑒定到692個響應(yīng)低鉀脅迫的基因、129個與低鉀耐性相關(guān)的蛋白質(zhì)以及61種代謝物，并分析了一些與逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，初步提出野生大麥耐低鉀的機理。SHU等［38］利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)對水稻幼苗對干旱脅迫的響應(yīng)作用進行分析，發(fā)現(xiàn)分別有71種蛋白質(zhì)、4 756個mRNA和37種代謝物的表達發(fā)生變化，認為干旱期間儲存物質(zhì)的能量物質(zhì)消耗增加，參與合成代謝途徑的酶的表達增加與6種氨基酸含量的增加相對應(yīng)，推測出干旱脅迫下碳水化合物和脂肪酸的能量轉(zhuǎn)換得到了增加。丁偉［39］對水稻干旱脅迫進行了3種組學(xué)研究，檢測到71個差異表達的蛋白、4 427個差異表達的基因以及38種差異表達的代謝物，表明干旱脅迫下重要基因、蛋白質(zhì)代謝物的表達及功能類群分布特征，同時為將來利用更多組學(xué)整合策略進一步研究水稻抗旱過程中的關(guān)鍵分子機制提供了新的切入點。

3 展望

近年來，以基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等為基礎(chǔ)的組學(xué)技術(shù)越來越多地運用在作物學(xué)耐逆境的研究中，推動著農(nóng)業(yè)第二次“綠色革命”，這皆得益于高效與廉價測序分析技術(shù)及手段的發(fā)展。通過多組學(xué)的綜合分析，研究人員對作物響應(yīng)逆境脅迫機理及代謝通路中的研究有了更加充分完整的理解，明晰響應(yīng)逆境的基因轉(zhuǎn)錄為mRNA，再翻譯成為蛋白質(zhì)后形成代謝物的網(wǎng)絡(luò)，更加精確闡釋關(guān)鍵功能基因的表達模式及通路［40-41］，目前已在作物抗逆、抗病機制、相關(guān)基因功能研究、種質(zhì)資源鑒定以及輔助育種中發(fā)揮著極其重要的作用。然而，多組學(xué)結(jié)合雖然能夠得到較多數(shù)據(jù)，但是如何更加充分地利用綜合分析的數(shù)據(jù)，對篩選到的核心數(shù)據(jù)的驗證以及在育種中的應(yīng)用都是研究人員后續(xù)研究的主要目標。