耿英楠 韋敏 毛豪麗

微環(huán)境對(duì)細(xì)胞的增殖和分化具有重要作用。在人體內(nèi)部，細(xì)胞被微環(huán)境包圍，微環(huán)境擠滿了可溶性因子、其他細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，其中大分子血漿蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的濃度達(dá)200～350 g/L[1]；另外，大腸桿菌內(nèi)蛋白質(zhì)和核糖核酸的總質(zhì)量濃度達(dá)300～400 g/L。這些大分子占據(jù)了細(xì)胞近40%的體積[2]。

大分子擁擠試劑通過發(fā)揮 “排斥容積效應(yīng)（EVE）”而達(dá)到改善微環(huán)境的作用，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的形成和重塑[3]?！芭懦馊莘e效應(yīng)”強(qiáng)調(diào)源于空間排斥的純物理非特異性效應(yīng)，很多大分子占據(jù)一定的體積，形成“部分體積占用（FVO）”，不被其他分子利用，從而形成一個(gè)高濃度的大分子微環(huán)境[2]。研究證明，大分子擁擠環(huán)境有助于干細(xì)胞在體外形成自己的基質(zhì)微環(huán)境，并影響了許多基本原理，例如酶反應(yīng)速率、細(xì)胞骨架的形成、細(xì)胞黏附和遷移等[4]。

以往的研究多是利用胎牛血清培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞研究大分子擁擠試劑對(duì)細(xì)胞行為的影響[5]。脂肪干細(xì)胞（ADSCs）來源豐富、易獲取，成為當(dāng)前干細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。ADSCs具有多向分化能力，并且免疫原性和免疫調(diào)節(jié)特性均較低[6]，被越來越多地應(yīng)用于骨組織再生的相關(guān)研究中[7]。在再生醫(yī)學(xué)研究中，細(xì)胞外基質(zhì)富含糖蛋白、蛋白聚糖和黏多糖等，支持細(xì)胞的黏附，并作為細(xì)胞生長(zhǎng)的源泉，為其再生提供豐富的條件[2]；另外，大分子擁擠環(huán)境對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分中的膠原蛋白、糖胺聚糖、生長(zhǎng)因子等都會(huì)產(chǎn)生影響。因此，本研究嘗試探索大分子擁擠環(huán)境對(duì)ADSCs成骨分化能力的影響，以及大分子擁擠試劑的最佳使用時(shí)間及其對(duì)ADSCs增殖能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

脂肪來源于抽脂患者（18～40歲），均獲患者知情同意。

低糖 DMEM（Hyclone，USA），胎牛血清（Gibco，Australia），地塞米松、維生素 C、β-磷酸甘油鈉（AmreSCO，USA），CCK-8 試劑盒（Dojindo，Japan），dsDNA核酸定量分析試劑盒（Quant-iTTMPicoGreenR，Invitrogen，USA），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司），茜素紅染液（上海索萊寶生物科技有限公司），膠原酶Ⅳ型（Sigma-C-5138，上海玉博生物科技有限公司），F(xiàn)icoll 400和Ficoll 70（GE Healthcare Bio-Science，Sweden）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ADSCs提取

將抽脂獲取的脂肪組織用無菌PBS沖洗干凈，加入用培養(yǎng)液配制好的等體積濃度（1%）的Ⅳ型膠原酶，37℃振蕩消化60～90 min。脂肪消化完全至乳糜狀后，1 500 r/min離心5 min，棄上層液體，加完全培養(yǎng)液重懸，1 500 r/min離心5 min，最后加入適量完全培養(yǎng)液重懸均勻，接種于培養(yǎng)皿，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以第3代ADSCs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)大分子擁擠對(duì)ADSCs增殖能力的影響

將第3代ADSCs以3 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)第2天，實(shí)驗(yàn)組每孔加入50 mg/mL無菌的Fc混合液（含25 mg/mL Ficoll 400和37.5 mg/mL Ficoll 70）100 μL；不加 Fc混合液的則為對(duì)照組。加入Fc混合液的第2天記為 D1，分別于D1、D2、D3、D7、D10，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。

1.2.3 dsDNA核酸定量和BCA蛋白濃度測(cè)定檢測(cè)大分子擁擠對(duì)ADSCs的DNA及蛋白質(zhì)合成的作用

將第3代ADSCs以 1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，待第2天細(xì)胞長(zhǎng)滿達(dá)80%左右，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液換為Fc混合液，對(duì)照組依舊用低糖DMEM換液。換成Fc混合液的第2天記為D1，分別于D3、D7用dsDNA定量試劑盒檢測(cè)ADSCs的DNA含量，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量。檢測(cè)均按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。

1.2.4 大分子擁擠環(huán)境對(duì)ADSCs成骨分化能力的影響

將第3代ADSCs以 1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，待第2天細(xì)胞長(zhǎng)滿達(dá)80%左右，分為4組：①對(duì)照組，只加入成骨誘導(dǎo)液；②實(shí)驗(yàn)組1，在加入Fc混合液同時(shí)，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液；③實(shí)驗(yàn)組2，加入Fc混合液3 d后加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液；④實(shí)驗(yàn)組3，加入Fc混合液3 d后加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。各組均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d換液。待成骨誘導(dǎo)至第14天時(shí)，1%茜素紅染色，觀察鈣結(jié)節(jié)沉積情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用GraphPad Prism軟件（Version 5.00，GraphPad Software，USA），數(shù)據(jù)以（x±s）表示。組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 大分子擁擠對(duì)ADSCs增殖能力的影響

CCK－8法檢測(cè)顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組ADSCs增殖均在第7天達(dá)到頂點(diǎn)，但實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖 1）。

圖1 ADSCs增長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of ADSCs

2.2 dsDNA核酸定量和BCA蛋白濃度測(cè)定結(jié)果

結(jié)果顯示，D3、D7實(shí)驗(yàn)組ADSCs的DNA和蛋白質(zhì)含量均高于對(duì)照組，差異顯著（P＜0.05）（圖 2）。

圖2 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)ADSCs的DNA和蛋白質(zhì)含量Fig.2 DNA and protein contents of ADSCs in the experimental and control groups at different time points

2.3 對(duì)成骨誘導(dǎo)的影響

成骨誘導(dǎo)第14天，細(xì)胞表面失去透光性，可見顆粒狀鈣鹽沉積，形成鈣化結(jié)節(jié)。茜素紅染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞間出現(xiàn)多個(gè)致密、圓形的深染紅色團(tuán)塊，呈現(xiàn)明顯的陽性反應(yīng)；對(duì)照組即未成骨誘導(dǎo)組染色陰性；3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，實(shí)驗(yàn)組1（Fc混合液與成骨誘導(dǎo)液同步加入）的鈣結(jié)節(jié)染色最深，鈣結(jié)節(jié)更多，細(xì)胞間出現(xiàn)大量致密圓形的深紅色團(tuán)塊（圖3）。

圖3 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的ADSCs茜素紅染色（40×）Fig.3 Alizarin red staining of ADSCs after osteogenic induction(40×)

3 討論

研究表明，大分子擁擠環(huán)境能以數(shù)量級(jí)的方式促進(jìn)細(xì)胞的熱力學(xué)過程和生物活性，從而優(yōu)化細(xì)胞的微環(huán)境，并有助于穩(wěn)定培養(yǎng)細(xì)胞或促進(jìn)分化[8]。本研究證實(shí)，大分子擁擠試劑所產(chǎn)生的微環(huán)境促進(jìn)了ADSCs的DNA和蛋白質(zhì)含量的增加，對(duì)細(xì)胞的增殖具有明顯的促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)c混合液與成骨誘導(dǎo)液同時(shí)使用時(shí)，ADSCs的成骨分化能力最佳，可能與大分子擁擠試劑所占的FVO產(chǎn)生的EVE有關(guān)。FVO是用來評(píng)估擁擠程度的一個(gè)重要參數(shù)[9]，理想情況下，應(yīng)該選擇與所培養(yǎng)的細(xì)胞類型的自然環(huán)境相對(duì)應(yīng)的FVO。本研究中使用的Ficoll 400和Ficoll 70均為不帶電荷分子，混合形成的Fc混合液的FVO為17%左右[2]，與ADSCs的自然環(huán)境較符合，能促進(jìn)ADSCs的增殖和分化。

大分子擁擠劑可通過EVE效應(yīng)產(chǎn)生一些物理變化來增加細(xì)胞外基質(zhì)中膠原含量和其他一些重要成分，如糖胺聚糖、生長(zhǎng)因子等。我們認(rèn)為，這種大分子擁擠試劑在組織工程與再生醫(yī)學(xué)研究中將具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。目前，大分子擁擠在骨組織工程中的應(yīng)用尚不多見，今后我們將會(huì)通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和更深入的體外實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證大分子擁擠環(huán)境在骨再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值，為相關(guān)研究提供更好的思路和方法。