黃晶晶，張福生，鄢 嫣，殷俊峰，周迎芹，謝寧寧*

（安徽省農業(yè)科學院農產品加工研究所，安徽 合肥 230031）

鐵是人體必需的微量元素之一，缺鐵性貧血（irondeficiency anemia，IDA）是由于體內缺少鐵，影響血紅蛋白合成而引起的一種貧血。IDA是我國普遍存在的營養(yǎng)缺乏性貧血，影響人口廣泛，發(fā)病率高，嚴重影響國民健康及生活質量[1]?？诜a鐵劑是目前世界范圍內治療IDA較為有效的途徑之一。市售補鐵劑種類繁多，分為無機鐵和有機鐵2 種作用形式[2]。以蛋白質水解所得多肽為螯合底物的復合微量元素補鐵劑是針對我國IDA人群開發(fā)的一種新型功能性產品，其具有含鐵量高、易消化吸收、生物利用率高等特點[3-5]，相對于氨基酸補鐵劑來說，其價格、生產工藝及成本更具優(yōu)勢。早在1960年，Newey等[6]通過實驗證實小肽螯合鐵可以直接被小腸吸收。多肽鐵螯合物以肽鏈中的氨基、羰基、羧基和羥基與鐵通過共價結合形成穩(wěn)定的五元或六元環(huán)狀結構[7]?，F有研究大多從魚皮[8-9]、魚類副產物[10-11]、其他低值水產品[12-13]、豆類[14-16]、花生[17]和米渣[18]等可食性動植物中獲得具有鐵螯合活性的小肽?？钓├俚萚18]制備的大米肽在最優(yōu)螯合條件下對氯化亞鐵的螯合能力為21.6 mg/g，螯合物得率為65.2%?；艚÷數萚11]發(fā)現，舟山帶魚下腳料水解多肽亞鐵螯合物的最佳螯合條件為抗壞血酸0.1%、溫度20 ℃、時間15 min、pH 7。此外，Lee等[19]利用風味蛋白酶從豬血漿蛋白水解物中獲得了鐵螯合活性壬肽Asp-Leu-Gly-Glu-Gln-Tyr-Phe-Lys-Gly。

豬血是生豬屠宰的副產品，是一種蛋白質含量高、糖類和脂肪含量低、微量元素含量豐富的食品工業(yè)原料[20]。豬血中蛋白質占4.3%，且為全價蛋白質[21]。同時，豬血鐵含量為45 mg/100 g，還含有鈣、鎂、鋅、銅、磷、鉀、鈉、錳、硒等微量元素[22]。豬血離心后，血漿液占65%，其中含有球蛋白和白蛋白等；血球液占35%，其中大部分是血紅蛋白[23-24]。我國是全球豬肉消費量最大的國家，2017年豬肉消費總量達5 487 萬t。我國也是全球生豬出欄量最大的國家，2017年生豬出欄量6.89 億頭[25]。因此，我國豬血資源利用產業(yè)的發(fā)展前景廣闊。

本研究以豬血為原料，利用堿性蛋白酶制備豬血多肽，以豬血自身離子化鐵和外源鐵元素作為鐵源，通過單因素試驗對豬血復合微量元素補鐵劑螯合工藝中的pH值、反應溫度、反應時間、多肽溶液質量分數、多肽溶液與FeCl2溶液體積比進行研究，在此基礎上采用響應面法優(yōu)化，以期制備出吸收率高、安全、無消化道刺激、沒有副作用的多肽亞鐵螯合物復合微量元素補鐵劑，為豬血蛋白資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬血，購自合肥萬潤食品有限公司。

鹽酸、硝酸、高氯酸、硫酸、氫氧化鈉、氯化亞鐵、硫酸鐵銨、檸檬酸鈉、抗壞血酸、乙醇、堿性蛋白酶 合肥博美生物科技有限公司；所有溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FD-1CE冷凍干燥機 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；1～10 mm石英微量比色皿 江蘇省無錫市晶禾光學儀器有限公司；1900PC雙光束紫外-可見分光光度計 上海譜元儀器有限公司；KT260全自動凱氏定氮儀 丹麥福斯分析儀器公司；HR801酶標分析儀 深圳市華科瑞科技有限公司；iCE 3500原子吸收光譜儀 美國賽默飛世爾公司；L-8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 復合微量元素補鐵劑制備工藝

復合微量元素補鐵劑制備工藝：豬血→離心分離→噴霧干燥→酶解→螯合→復合微量元素補鐵劑

操作要點：向豬血中加入0.4 mg/L的檸檬酸鈉抗凝，于4 ℃、3 500 r/min條件下離心15 min，獲得血漿液和血球液，分別噴霧干燥制得血漿粉和血球粉，然后分別進行酶解，中性蛋白酶添加量0.01 mg/L，底物質量濃度150 g/L，酶解溫度45 ℃，酶解時間4 h；酶解結束后于90 ℃水浴滅酶6 min，分別制得血漿酶解液和血球酶解液，隨后，將血球酶解液于3 000 r/min離心20 min，所得沉淀酸解成離子態(tài)；最后，將所得酸解液、離心上清液與血漿酶解液混合，于35 ℃、pH 6條件下螯合反應5 h，干燥成粉，即得復合微量元素補鐵劑。

1.3.2 理化與營養(yǎng)檢測

水分含量：參照GB/T 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》[26]中的直接干燥法；蛋白質含量：參照GB/T 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》[27]中的凱氏定氮法；脂肪含量：參照GB/T 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》[28]中的索氏抽提法；鐵含量：參照GB/T 5009.90—2016《食品安全國家標準 食品中鐵的測定》[29]中的火焰原子吸收光譜法；氨基酸組成分析：參照GB/T 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》[30]。

1.3.3 鐵的離子化

豬血自身含有豐富的鐵元素，在螯合前需將鐵離子化，以便根據不同需求進行添加。血漿蛋白和血球蛋白分別酶解離心，所得沉淀冷凍干燥，用稀鹽酸溶解，調節(jié)pH值至4～5，加入3%抗壞血酸標準溶液，制得沉淀酸解液備用。同時，酸化外源鐵溶液（1.0 mol/L FeCl2溶液中加入3%抗壞血酸標準溶液）作為螯合反應的鐵源。

1.3.4 豬血多肽溶液制備

稱取一定量的血漿蛋白粉和血球蛋白粉，分別進行酶解，離心取上清液，加入質量分數為2%的活性炭，溫度57 ℃、pH 4.3條件下脫色60 min；然后，采用中空纖維超濾設備，選取截留分子質量為10 kD的纖維柱進行分離及脫色，以除去大分子蛋白類物質，在旋轉蒸發(fā)器上濃縮至原體積的1/10，最后進行冷凍干燥，制得多肽粉成品。使用時，用去離子水溶解多肽粉，配制成不同質量分數的多肽溶液。

1.3.5 Fe2+螯合率測定

以谷胱甘肽（glutathione，GSH）（20 mg/mL）和乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（5 mg/mL）作為陽性對照組，含有FeCl2和豬血多肽的溶液作為空白組。鐵含量采用火焰原子吸收光譜法測定[29]。Fe2+螯合率按照下式計算。

式中：c樣品、c空白和c總分別為肽-Fe2+、豬血多肽、FeCl2和豬血多肽混合溶液的鐵含量。

1.3.6 單因素試驗設計

選擇pH值、反應溫度、反應時間、多肽溶液質量分數、多肽溶液與FeCl2溶液（1.0 mol/L）體積比5 個因素作為主要單因素，考察各因素對多肽Fe2+螯合率的影響。

多肽溶液質量分數為2%、多肽溶液與FeCl2溶液的體積比為2∶1時，加入固定體積的沉淀酸解液，溫度30 ℃，分別在pH值3、4、5、6、7條件下反應1 h，測定不同pH值條件下的Fe2+螯合率。

多肽溶液質量分數為2%、多肽溶液與FeCl2溶液的體積比為2∶1時，加入固定體積的沉淀酸解液，pH值為6，反應時間1 h，測定在25、35、45、55、65 ℃反應溫度下的Fe2+螯合率。

多肽溶液質量分數為2%、多肽溶液與FeCl2溶液的體積比為2∶1時，加入固定體積的沉淀酸解液，pH值為6，反應溫度30 ℃，測定反應時間為15、25、35、45、55 min條件下的Fe2+螯合率。

配制質量分數分別為1%、2%、3%、4%、5%的多肽溶液，多肽溶液與FeCl2溶液的體積比為2∶1，加入固定體積的沉淀酸解液，pH值為6，反應時間1 h，反應溫度30℃，測定不同質量分數多肽溶液的Fe2+螯合率。

多肽溶液質量分數為2%，多肽溶液與FeCl2溶液的體積比分別選擇1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，加入固定體積的沉淀酸解液，反應溫度30 ℃，pH值為6，反應時間1 h，測定不同多肽溶液1.0 mol/L與FeCl2溶液體積比時的Fe2+螯合率。

1.3.7 響應面試驗因素及水平

根據Box-Behnken試驗設計方案，綜合單因素試驗結果，選擇單因素試驗中的顯著因素（pH值、多肽溶液質量分數和多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比）進行優(yōu)化，因素水平設計如表1所示。

表 1 響應面試驗因素水平表Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

1.4 數據處理

每個處理組進行3 次獨立實驗，結果以平均值±標準差表示。利用Design-Expert 8.0.5軟件，通過單因素方差分析和Duncan's多重比較分析數據顯著性并作圖。

2 結果與分析

2.1 豬血粉和復合微量元素補鐵劑的理化及營養(yǎng)指標

表 2 豬血粉和復合微量元素補鐵劑的理化及營養(yǎng)指標Table 2 Chemical and nutritional compositions of pig blood powder and composite microelement iron supplement

由表2可知：豬血粉的水分含量相對較高，為10.060%，粗脂肪含量相對較低，僅0.410%；制備成復合微量元素補鐵劑后水分含量下降至7.660%，粗脂肪含量上升為1.510%。此外，復合微量元素補鐵劑的鐵含量達到2 280 mg/kg，相比豬血粉顯著提高（P＜0.05）。

2.2 豬血粉和復合微量元素補鐵劑的氨基酸組成

表 3 豬血粉和復合微量元素補鐵劑的氨基酸組成Table 3 Amino acid compositions of pig blood powder and composite microelement iron supplement%

由表3可知：豬血粉和復合微量元素補鐵劑中均檢出16 種氨基酸（色氨酸在水解時被破壞，故未檢出），其中必需氨基酸7 種，氨基酸含量較為豐富。豬血粉的必需氨基酸總量為43.360%，復合微量元素補鐵劑的必需氨基酸總量略低，為41.990%，其中亮氨酸含量最高，為11.900%，賴氨酸次之，為8.650%。

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 pH值對Fe2+螯合率的影響

由圖1可知：pH值由3升高至5時，Fe2+螯合率隨著pH值的升高而增加（P＜0.05），在pH值為5時達到最大；當pH值繼續(xù)升高時，Fe2+螯合率又顯著減?。≒＜0.05）。這可能是由于當pH值大于5時，酸堿度影響了豬血多肽螯合底物的空間構象[31]和鐵元素的形態(tài)，從而影響了鐵離子與底物的結合，故反應時pH值應控制在5左右。

圖1 pH值對Fe2＋螯合率的影響Fig. 1 Effect of pH value on Fe2＋ chelating rate

圖2 反應溫度對Fe2＋螯合率的影響Fig. 2 Effect of reaction temperature on Fe2＋ chelating rate

2.3.2 反應溫度對Fe2+螯合率的影響由圖2可知，反應溫度在25～65 ℃范圍內變化時，Fe2+螯合率沒有顯著變化（P＞0.05），因此，反應溫度控制在25 ℃左右即可。

2.3.3 反應時間對Fe2+螯合率的影響

圖3 反應時間對Fe2＋螯合率的影響Fig. 3 Effect of reaction time on Fe2＋ chelating rate

由圖3可知，反應時間在15～55 min范圍內變化時，Fe2+螯合率沒有顯著變化（P＞0.05）。因此，為提高實驗和生產效率，反應時間在15 min左右即可。

2.3.4 多肽溶液質量分數對Fe2+螯合率的影響

由圖4可知：多肽溶液質量分數從1%上升至3%時，Fe2+螯合率隨著多肽溶液質量分數的升高而增加（P＜0.05），在多肽溶液質量分數為3%時達到最大；當多肽溶液質量分數繼續(xù)升高時，Fe2+螯合率又顯著降低（P＜0.05）。故反應時多肽溶液質量分數應控制在3%左右。

圖4 多肽溶液質量分數對Fe2＋螯合率的影響Fig. 4 Effect of peptide concentration on Fe2＋ chelating rate

2.3.5 多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比對Fe2+螯合率的影響

圖5 多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比對Fe2＋螯合率的影響Fig. 5 Effect of volume ratio of peptide solution to FeCl2 solution(1.0 mol/L) on Fe2＋ chelating rate

由圖5可知：當多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液的體積比低于3∶1時，Fe2+螯合率隨著體積比的升高而增加（P＜0.05），在體積比為3∶1時達到最大值；當體積比持續(xù)升高至5∶1時，Fe2+螯合率反而下降（P＜0.05）。故反應時多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液的體積比應控制在3∶1左右。

通過以上5 個條件的豬血多肽Fe2+螯合率單因素試驗可以發(fā)現，pH值、多肽溶液質量分數、多肽溶液與FeCl2溶液體積比3 個因素的變化對Fe2+螯合率具有顯著影響（P＜0.05），而反應溫度和反應時間對于多肽的Fe2+螯合率影響不顯著（P＜0.05）。霍健聰等[11]對帶魚下腳料蛋白多肽亞鐵螯合物的研究結果也證明pH值的影響顯著。在后續(xù)的響應面試驗中，僅針對pH值、多肽溶液質量分數、多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比3 個因素進行螯合工藝的優(yōu)化。根據單因素試驗結果，固定反應溫度為25 ℃、反應時間為15 min。

2.4 響應面優(yōu)化試驗結果與分析

2.4.1 響應面優(yōu)化試驗結果及其方差分析

根據Design-Expert 8.0.5軟件設計3因素3水平的響應面試驗，結果如表4所示。

表 4 復合微量元素補鐵劑螯合工藝的響應面分析結果Table 4 Box-Behnken design with experimental results

采用軟件程序對以上的實驗數據進行二次多元回歸擬合，分析結果得出多肽Fe2+螯合率的回歸方程為：Y=-139.106 0+73.745 0A-1.116 5B+13.593 5C-0.865 0AB-1.380 0AC+3.415 0BC-6.146 0A2-0.636 0B2-3.056 0C2。

表 5 響應面回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance of response surface regression model

為檢驗上述方程的有效性，對回歸模型進行方差分析。由表5可知，模型顯著（P＜0.05），說明該模型能夠解釋大部分實驗情況的變化，同時失擬項不顯著，進一步說明了該模型的合理性。因此，可以用此模型對整個實驗結果進行分析和預測。

3 個因素對補鐵劑Fe2+螯合率的影響比較復雜。在上述回歸方程的所有一次項中，對于多肽的Fe2+螯合率影響順序為A＞C＞B，其中A項影響極顯著（P＜0.000 1），即pH值對螯合率的影響較大；在所有的平方項中，A2和C2項影響顯著（P＜0.05）；而交互項中僅BC交互項的影響顯著（P＜0.05）。因此，各因素對補鐵劑Fe2+螯合率的影響順序為pH值＞多肽溶液質量分數＞多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比。

2.4.2 響應面優(yōu)化試驗的兩因素交互作用分析

采用Design-Expert 8.0.5軟件，帶入實驗數據，分別將模型中的pH值（A）、多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比（B）及多肽溶液質量分數（C）的其中1 個因素固定在0水平不變，得到其余2 個因素之間的相互作用對Fe2+螯合率的影響。通過軟件的Model Graphs分別合成因素間交互作用影響的三維圖和等高線圖。

圖6 pH值和多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比對Fe2＋螯合率交互作用影響的三維圖和等高線圖Fig. 6 Three-dimensional response surface and contour plots showing the effect of interaction between pH value and volume ratio of peptide solution to (1.0 mol/L) FeCl2 solution on Fe2＋ chelating rate

由圖6可知：當多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比為3∶1，pH值在4.0～5.0范圍內增加時，豬血多肽的Fe2+螯合率迅速上升，pH值在5.0～6.0范圍內增加時，豬血多肽的Fe2+螯合率緩慢下降；pH值為5.0時，豬血多肽的Fe2+螯合率隨著多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比的增加而緩慢上升。

由圖7可知：當多肽溶液質量分數為3%，pH值在4.0～5.0范圍內增加時，豬血多肽的Fe2+螯合率迅速上升，pH值在5.0～6.0范圍內增加時，豬血多肽的Fe2+螯合率緩慢下降；pH值為5.0時，豬血多肽的Fe2+螯合率隨著多肽溶液質量分數的增加先上升后下降。

圖7 pH值和多肽溶液質量分數對Fe2＋螯合率交互作用影響的三維圖和等高線圖Fig. 7 Three-dimensional response surface and contour plots showing the effect of interaction between pH value and peptide concentration on Fe2＋ chelating rate

圖8 多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比和多肽溶液質量分數對Fe2＋螯合率交互作用影響的三維圖和等高線圖Fig. 8 Three-dimensional response surface and contour plots showing the effect of interaction between volume ratio of peptide solution to FeCl2 solution (1.0 mol/L) and peptide concentration on Fe2＋ chelating rate

由圖8可知：當多肽溶液質量分數為3%，多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液的體積比在2∶1～3∶1范圍內增加時，豬血多肽的Fe2+螯合率緩慢上升，體積比在3∶1～4∶1范圍內增加時，Fe2+螯合率基本不變；多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液的體積比為3∶1時，豬血多肽的Fe2+螯合率隨著多肽溶液質量分數的增加先緩慢上升后下降。

2.5 最佳螯合工藝條件的確定

根據Design-Expert 8.0.5軟件程序對螯合工藝條件進行優(yōu)化，得到最佳螯合工藝條件為pH值5.40、多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比2.16∶1、多肽溶液質量分數2.27%。在此工藝條件下，補鐵劑Fe2+螯合率的預測值為79.37%。

在上述最佳螯合工藝條件下進行3 次平行實驗，結果取平均值，獲得實測補鐵劑Fe2+螯合率為79.41%，較預測值高0.04%。證明響應面分析法對于螯合工藝的優(yōu)化結果準確可靠，有較高的實用價值。

3 結 論

豬血原料經過離心、酶解、酸解及螯合等工藝，可以得到鐵含量豐富的復合微量元素補鐵劑。在單因素試驗中發(fā)現，pH值、多肽溶液質量分數、多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比3 個因素對補鐵劑的Fe2+螯合率具有顯著影響，而反應溫度和反應時間則影響不顯著。選擇反應溫度25 ℃、反應時間15 min作為固定條件，通過響應面試驗優(yōu)化獲得復合微量元素補鐵劑的最佳螯合工藝條件為pH值5.40、多肽溶液質量分數2.27%、多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比2.16∶1，在此條件下，補鐵劑Fe2+螯合率的預測值為79.37%。本研究僅針對豬血加工制備復合微量元素補鐵劑的工藝進行優(yōu)化，仍需要進行產品效果的后續(xù)驗證等研究。