肉制品中羊源性成分的定性和定量檢測

錢俊平，郭 梁*，海 小，郭元晟，雅 梅

（錫林郭勒職業(yè)學(xué)院生物工程研究院，錫林郭勒食品檢驗檢測和風險評估中心，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000）

肉制品是人類膳食結(jié)構(gòu)的重要組成部分，肉制品中富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)（包括微量元素）等營養(yǎng)物質(zhì)，這些營養(yǎng)成分不僅是組成宏觀人體和微觀細胞的基礎(chǔ)，也是調(diào)控人體生命活動和細胞內(nèi)生物化學(xué)反應(yīng)的重要基礎(chǔ)物質(zhì)[1]。肉制品除了含有豐富的常規(guī)營養(yǎng)成分之外，色、香、味俱佳的感官體驗更是賦予其美食的內(nèi)核。然而，伴隨著日益增長的生產(chǎn)量和消費量，肉制品成為在食品生產(chǎn)、加工、流通及餐飲領(lǐng)域中造假摻假的主要目標[2-3]。一些不法企業(yè)和商販用低價肉或非肉成分冒充高價肉，在牛肉、羊肉、鹿肉等高價肉制品中摻雜雞肉、鴨肉等低價肉。這些造假摻假的欺詐違法行為對人類健康、消費者權(quán)益、市場公平交易機制及民族宗教等各方面都產(chǎn)生了巨大威脅[4-5]。動物源性成分檢測技術(shù)能夠應(yīng)對上述問題，除了能保護消費者合法權(quán)益、維持市場公平交易機制、維護及尊重民族傳統(tǒng)和宗教信仰，還能預(yù)防動物源性疾?。ǒ偱２?、口蹄疫及牛海綿狀腦病等）的傳播[6-8]。

羊肉是消費者廣泛食用的家畜肉之一，羊肉不僅營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)細嫩、容易消化、具有高蛋白、低脂肪、含磷脂多、膽固醇少的特點，同時羊肉的食用也沒有宗教和文化的禁忌。目前，動物源性成分檢測技術(shù)建立在對樣品蛋白質(zhì)、脂肪酸及核酸等分子結(jié)構(gòu)、組成特異性或種屬標簽序列分析的基礎(chǔ)上，通過種屬特異分子鑒別肉制品的動物來源[9-11]。動物制品真?zhèn)舞b別所涉及的技術(shù)手段包括電泳[12-13]、免疫組化[14-15]、質(zhì)譜[16]、色譜[17]、膜芯片[18]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[19-20]和聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[21-23]。由于蛋白質(zhì)和脂肪酸在肉制品生產(chǎn)、加工、貯藏及運輸過程中的不穩(wěn)定性，使得相應(yīng)檢測技術(shù)耗時長、前處理復(fù)雜多樣及檢測成本較高；而脫氧核糖核酸（DNA）作為遺傳物質(zhì)包含全部遺傳信息，并且基于其穩(wěn)定性高的特點，加工過程中很難被破壞，是非常理想的標記物，能夠很好地進行物種標記，用于準確鑒定動物制品的物種源性[24]。目前，以DNA為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)是全球肉制品真?zhèn)舞b別的主流技術(shù)[25-26]。其中，實時熒光PCR（real-time PCR，RT-PCR）技術(shù)以低耗時、強特異性、高靈敏度及高通量等優(yōu)點成為近期研究熱點。RT-PCR技術(shù)使用熒光染料（SYBR Green或EvaGreen）[27-29]或探針（TaqMan）[30-31]，通過對每個循環(huán)的擴增產(chǎn)物進行實時監(jiān)測，實現(xiàn)對目標DNA模板的定性和定量檢測。相比以熒光染料為檢測手段的RT-PCR技術(shù)，探針技術(shù)由于引入種屬特異的TaqMan探針，提高了RT-PCR的特異性。目前，RT-PCR技術(shù)是動物源性成分檢測的主流技術(shù)手段，相比普通PCR技術(shù)，其具有快速和高通量的特點，相比膜芯片和測序技術(shù)具有低成本和擁有潛在定量能力的特點，而且通過引物和探針的設(shè)計和優(yōu)化可以實現(xiàn)多通道多源性同步檢測。利用RT-PCR技術(shù)定性及定量檢測動物源性成分已有大量報道。然而，其中還存在一些問題，如混合樣品的檢測靈敏度和定量曲線的適用性（用于鮮肉和加工肉制品）等。

本研究根據(jù)GB/T 25165—2010《明膠中牛、羊、豬源性成分定性檢測方法 實時熒光PCR法》[32]設(shè)計引物和探針，建立鮮肉及加工肉制品中羊源性成分的TaqMan RT-PCR檢測方法，并在標準的基礎(chǔ)上利用DNA梯度稀釋液為模板，評價方法的檢測限，建立定量標準曲線，探討方法的定量檢測能力，并在此基礎(chǔ)上對混合樣品的檢測靈敏度以及定量曲線在加工肉制品中的適用性進行研究，為下一步研發(fā)具有定性和定量檢測能力的方法和標準提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮肉（羊肉、黃牛肉、牦牛肉、水牛肉、豬肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉、兔肉、鴨肉和雞肉）及加工肉制品（蒙羊羊肉干、尚清齋雞肉烤腸、金鑼火腿腸、肉粒多火腿腸、呼納斯牛肉干、金蒙典牛肉干、馬肉干和五香驢肉）購于錫林浩特市德克隆超市及109農(nóng)貿(mào)市場。鮮肉樣品采集自肌肉組織，在采集和分裝過程中避免交叉污染，-20 ℃保存。

TransStart Probe qPCR SuperMix購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物和探針由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

5418R Centrifuge高速臺式離心機 德國Eppendorf公司；Nanodrop 2000c核酸蛋白測定儀 美國Thermo Fisher公司；7300 Plus實時熒光PCR擴增儀 美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針

根據(jù)GB/T 25165—2010，委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成引物和探針。引物與探針序列如表1所示。

表 1 引物和探針序列Table 1 Primer and probe sequences used in this study

1.3.2 DNA提取

取10～20 mg肉制品樣品，用液氮進行研磨，利用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法[33]提取其DNA，通過Nanodrop 2000c核酸蛋白分析儀測定其質(zhì)量濃度；將母液稀釋至100 ng/μL左右，保存于-20 ℃。

1.3.3 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

反應(yīng)體系（20 μL）：TransStart Probe qPCR SuperMix 10 μL、左引物和右引物各1 μL、探針1 μL、模板DNA 1 μL，補水至20 μL。

反應(yīng)條件：94 ℃、1 min，1 個循環(huán)；94 ℃、5 s，60 ℃、31 s，45 個循環(huán)。

1.3.4 特異性實驗

分別提取12 種動物鮮肉組織（羊肉、黃牛肉、牦牛肉、水牛肉、豬肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉、兔肉、鴨肉和雞肉）的DNA，對其進行RT-PCR擴增實驗。根據(jù)PCR反應(yīng)的循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）值檢驗方法對于不同動物鮮肉組織的特異性。

混合樣品（羊肉和豬肉）的制備：分別稱取相應(yīng)質(zhì)量的羊肉和豬肉，利用液氮和研磨器制作羊肉質(zhì)量分數(shù)為0.1%、1.0%、10.0%、30.0%、70.0%、90.0%、99.0%和99.9%的混合樣品。分別提取8 種混合樣品的DNA，對其進行RT-PCR擴增。

1.3.5 靈敏度實驗

用滅菌ddH2O稀釋羊肉DNA（質(zhì)量濃度100 ng/μL），共8 個梯度，質(zhì)量濃度分別為100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/μL。以不同質(zhì)量濃度的DNA為模板進行RT-PCR反應(yīng)，根據(jù)Ct值檢驗方法對于不同質(zhì)量濃度模板DNA的檢測靈敏度。

1.3.6 加工肉制品中羊源性成分的檢測

分別提取不同加工肉制品的DNA，對其進行RT-PCR擴增實驗。根據(jù)PCR反應(yīng)的Ct值檢驗方法對于加工肉制品的適用性。用滅菌ddH2O稀釋羊肉干DNA（質(zhì)量濃度100 ng/μL），共8 個梯度，質(zhì)量濃度分別為100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/μL。以不同質(zhì)量濃度的羊肉干來源DNA為模板進行RT-PCR反應(yīng)，根據(jù)Ct值檢驗方法對于不同質(zhì)量濃度羊肉干模板DNA的檢測靈敏度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用RT-PCR擴增儀（ABI 7300 Plus）分析軟件對擴增結(jié)果進行擴增曲線和Ct值的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊源性成分檢測特異性實驗

圖1 12 種鮮肉樣品中羊源性成分的擴增曲線Fig. 1 Amplif i cation curves of sheep-derived ingredients in 12 raw meats

利用羊源性成分檢測的引物和探針對羊肉、黃牛肉、牦牛肉、水牛肉、豬肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉、兔肉、鴨肉和雞肉的DNA進行TaqMan RT-PCR擴增實驗。由圖1和表2可知，羊肉鮮肉樣品（5 個羊肉樣品，每個樣品3 個平行）出現(xiàn)特異性擴增曲線，5 個羊肉樣品的Ct值分別為（18.59±0.26）、（17.77±0.06）、（16.94±0.04）、（18.38±0.61）和（16.99±0.19），其他11 種動物鮮肉樣品DNA均未出現(xiàn)典型擴增曲線。以上結(jié)果說明，本研究用于動物源性成分檢測的引物和探針具有羊源性特異性，可以用于羊肉的真?zhèn)舞b定。

表 2 引物和探針的特異性擴增結(jié)果Table 2 Specif i c amplif i cation with the primers and probes

2.2 混合樣品中羊源性成分的鑒定

圖2 混合樣品中羊源性成分的擴增曲線Fig. 2 Amplif i cation curves of sheep-derived ingredients in meat mixtures

表 3 混合樣品中羊源性成分的鑒定結(jié)果Table 3 Identi fi cation of sheep-derived ingredients in meat mixtures

由圖2和表3可知，8 種混合樣品均出現(xiàn)典型特異性擴增曲線，羊肉含量為0.1%的混合樣品Ct值為（28.88±0.15）。以上結(jié)果說明，混合樣品并不會對羊源性成分鑒定產(chǎn)生干擾，并且可以檢出混合樣品中0.1%以上的羊肉成分。

2.3 羊源性成分檢測靈敏度實驗

圖3 羊肉DNA梯度稀釋模板的RT-PCR擴增曲線Fig. 3 RT-PCR amplif i cation curves with diluted ovine DNA as templates

表 4 羊肉DNA梯度稀釋模板的RT-PCR擴增結(jié)果Table 4 RT-PCR ampli fi cation results with diluted ovine DNA as templates

由圖3和表4可知：當羊肉DNA模板質(zhì)量濃度稀釋至0.01 ng/μL（即10 pg羊源DNA/μL）時，RT-PCR出現(xiàn)典型擴增曲線，Ct值為（33.44±0.08），x為DNA質(zhì)量濃度的對數(shù)，y為Ct值。當羊肉DNA模板稀釋至0.001 ng/μL時，未出現(xiàn)典型擴增曲線，Ct值為0.00。以上結(jié)果說明，羊特異性引物和探針的檢測靈敏度達0.01 ng/μL，即RT-PCR反應(yīng)可以檢出10 pg羊源DNA。

2.4 羊源性成分的定量檢測

對羊肉來源DNA的8 個梯度稀釋模板進行RT-PCR擴增實驗。得到羊源性成分定量檢測的標準曲線方程為y=-3.939x+48.826（R2=0.990 8），x為DNA質(zhì)量濃度的對數(shù)，y為Ct值。利用標準曲線，通過檢測鮮肉中羊源性成分的Ct值計算羊源DNA模板質(zhì)量濃度。說明檢測方法中羊源性成分檢測的引物和探針不僅可以對肉制品中的羊源性成分進行定性檢測，而且具備定量檢測能力。

2.5 加工肉制品中羊源性成分的定量檢測

由圖4A和表5可知，2 種羊肉干（每種樣品3 個平行）出現(xiàn)特異性擴增曲線，Ct值分別為（26.01±0.21）和（24.15±1.26），其余加工肉制品并無擴增曲線，Ct值均為0.00。

利用羊源性成分檢測的引物和探針，以羊肉干來源DNA梯度稀釋溶液為模板，進行加工肉制品（羊肉干）的TaqMan RT-PCR擴增實驗。由圖4B可知，當模板DNA質(zhì)量濃度稀釋至0.1 ng/μL時，RT-PCR仍出現(xiàn)典型擴增曲線，Ct值為（34.74±0.21）。以上結(jié)果說明，羊特異性引物和探針對于加工肉制品（羊肉干）的檢測靈敏度為0.1 ng/μL，即RT-PCR反應(yīng)可以檢出0.1 ng羊肉干來源DNA。

圖4 加工肉制品中羊源性成分檢測的擴增曲線及靈敏度檢測Fig. 4 Amplif i cation curves and sensitivity of detection of sheep-derived ingredients in processed meat products

表 5 11 種加工肉制品中羊源性成分檢測的RT-PCR擴增結(jié)果Table 5 RT-PCR ampli fi cation results of sheep-derived ingredients in 11 processed meat products

對羊肉干來源DNA的8 個梯度稀釋模板進行RT-PCR擴增實驗。得到加工肉制品中羊源性成分定量檢測的標準曲線方程為y=-4.011x+54.464（R2=0.995 3）。利用標準曲線，通過檢測肉制品（羊肉干）中羊源性成分的Ct值（22.84、26.41、29.99）計算出DNA模板的質(zhì)量濃度為75.9、9.8、1.3 ng/μL，計算結(jié)果與原始質(zhì)量濃度（100、10、1 ng/μL）偏差較小。以上結(jié)果說明，此方法具有較高的適用性及特異性，可用于市售加工肉制品中的羊源性成分的定性和定量檢測。

3 結(jié) 論

根據(jù)GB/T 25165—2010合成應(yīng)用于明膠中羊源性成分定性檢測的引物和探針，利用鮮肉和加工肉制品對以此引物和探針為基礎(chǔ)的羊源性成分檢測方法進行特異性實驗。利用混合樣品進行羊源性成分的鑒定，結(jié)果表明，混合樣品并不會對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾，并且本方法可以檢出混合樣品中含量為0.1%的羊肉。在特異性的基礎(chǔ)上拓展了靈敏度檢測，結(jié)果表明，此方法可以檢出10 pg的羊源DNA。由于此方法使用TaqMan RT-PCR，相比常規(guī)PCR表現(xiàn)出特異性更強、檢測效率更高的優(yōu)勢。RT-PCR可以利用熒光信號對PCR產(chǎn)物進行實時監(jiān)控，具有定量模板的能力。鑒于此方法的定量潛力，利用梯度稀釋模板得到定量標準曲線方程y=-3.939x+48.826（R2=0.990 8），探討羊源性成分的定量檢測潛力，發(fā)現(xiàn)此方法具有羊源性DNA定量檢測能力。最后，對加工肉制品（肉干和香腸）進行羊源性成分的定量檢測，結(jié)果表明，此方法可以對來源于加工肉制品的DNA進行定量檢測。

本研究分別對羊肉和羊肉干進行羊源性成分檢測的靈敏度實驗和DNA定量檢測曲線的構(gòu)建，結(jié)果表明，羊肉干的檢測靈敏度較低。推測加工肉制品（羊肉干）中的DNA存在降解情況，導(dǎo)致有效DNA模板較少，使得靈敏度相比鮮肉較低。在定量檢測曲線的構(gòu)建中發(fā)現(xiàn)，羊肉和羊肉干的DNA定量曲線并不相同。以上結(jié)果說明，動物源性成分檢測的靈敏度和定量曲線由于樣品類型的不同而有較大差異。本研究團隊前期將多物種線粒體基因序列比對設(shè)計應(yīng)用于羊源性成分檢測的引物和探針，可以檢測出1 pg的羊源DNA，并且構(gòu)建了定量檢測標準曲線（R2=0.976）[34]。李亮等[35]研發(fā)出的牛源性成分檢測技術(shù)的靈敏度達10 pg/μL，而付理文等[36]研發(fā)的應(yīng)用于羊源性成分檢測的引物和探針可以檢出85 pg的羊源DNA。雖然本研究方法檢測羊源性成分的靈敏度并沒有達到1 pg，但是對于動物源性檢測已經(jīng)足夠，更為重要的是此方法具有羊源性DNA的定量檢測能力。