劉 旭 丁由中

(1.國家海洋局海島研究中心，平潭，350400；2.華東師范大學生命科學學院，上海，200062)

由于人類的亂捕濫獵和環(huán)境的不斷惡化，許多動物瀕臨滅絕境地，人們迫切要求了解這些動物的生存狀況，從而采取適當?shù)谋Ｗo和管理措施。近年來，瀕危野生動物的保護主要集中在遺傳多樣性方面的保護，微衛(wèi)星技術正是遺傳多樣性研究的重要手段之一。隨著微衛(wèi)星等分子生物學技術的發(fā)展，研究者可以通過一些分子標記來研究種群的擴散模式，從而可以更加有效地保護和管理野生動物[1]。

1 糞便分子生物學

1.1 糞便分子生物學在瀕危物種保護中的應用

糞便分子生物學技術就是從動物糞便中提取動物基因組DNA，然后借助PCR技術和多種分子標記，從而對動物進行遺傳分析的研究[2]。瀕危野生動物的保護目前主要集中在遺傳多樣性方面的保護。而要獲取動物的遺傳信息，必須采集含有遺傳物質的樣品進行分析。在20世紀六七十年代，通常采用損傷性取樣法，如殺死研究對象以獲得新鮮樣品，由于這種取樣方法常常對動物資源造成極大破壞，其應用范圍受到很大限制。以糞便學為基礎的糞便取樣分析方法，在很大程度上解決了這一問題。而且糞便的采集要比血液和組織的采集更容易、更方便，一般不會對瀕危動物的身體和生活造成任何不利影響，這對瀕危動物的保護有十分重要的實際意義。

1.2 糞便作為分子生物學研究材料的可行性

糞便的主要成分是未消化的食物殘渣，這些食物殘渣在通過腸道時經常會夾雜有大量的脫落的腸道上皮細胞。據(jù)研究報道，每個人每克新鮮糞便中就含有100 000個腸道上皮細胞[3]，而且大部分是活細胞，這就意味著研究者可以從糞便中獲取糞便產生者的DNA進行遺傳分析，也就是說它具備核DNA的所有標記，例如RFLP、RAPD和AFLP，以及微衛(wèi)星標記等，這對于瀕危野生動物的遺傳學研究有非常重要的意義；另外，在野外自然條件下采集的新鮮糞便在酒精中保存半年以后仍能成功地提取出DNA，而且發(fā)現(xiàn)在干燥或冷凍的條件下也能很好地保存糞便樣品[4]，這說明野生瀕危動物的糞便采樣及保存是十分可行的。相關的實驗已有報道，如Reed等利用微衛(wèi)星技術對82個海豹(Phocidae)糞便樣品成功地進行了個體識別和種群大小的估計，同時他們還利用性染色體上的SRY-Y53-3C，SRY-Y53-3D引物對海豹糞便DNA進行擴增，結果從40個海豹糞便樣品檢測到1例雄性個體[5]。在國內方盛國等通過對大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)的糞便DNA的提取，同時借助限制性酶切、分子雜交、同位素標記等技術成功地構建了大熊貓指紋圖譜[6-7]。由此可見，糞便分子生物學方法正在成為野生動物遺傳學分析的重要工具。

2 微衛(wèi)星DNA

微衛(wèi)星DNA也被稱為數(shù)目可變的串聯(lián)重復、短串聯(lián)重復、簡單序列重復和簡單序列長度多態(tài)，是指以1—6個核苷酸為基本重復單位的串聯(lián)重復序列[8]。它們廣泛存在于各類真核生物基因組中，原核生物基因組中也含有少量的微衛(wèi)星序列。微衛(wèi)星序列具有種類多、分布廣泛、高度多態(tài)性、雜合性高、重組率低的特點，在群體中變易范圍大，構成了豐富的長度多態(tài)性，有高度的個體特異性，并遵循孟德爾共顯性遺傳規(guī)律，是近年來飛速發(fā)展起來的一類新型的DNA高度多態(tài)性遺傳標記系統(tǒng)。目前，微衛(wèi)星技術已廣泛應用于高分辨率的遺傳連鎖圖譜的構建，對人類疾病的診斷和鑒別、群體遺傳研究、法醫(yī)上的人身鑒定以及親屬血緣關系鑒定等[9]。

2.1 微衛(wèi)星DNA位點的獲得

為了從微衛(wèi)星DNA中得到有效的生物學信息，微衛(wèi)星DNA位點的獲得是微衛(wèi)星分析的關鍵。目前獲得微衛(wèi)星位點的途徑主要有兩種：一是基于微衛(wèi)星DNA文庫克隆所需要的微衛(wèi)星位點。這種方法包括構建DNA文庫、篩選克隆片段、測序和根據(jù)序列設計PCR的引物以進行微衛(wèi)星位點的擴增。這種方法可以一次性獲得成百上千個微衛(wèi)星位點，其缺點是操作煩瑣，工作量大，且耗資巨大。二是利用已發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星位點尋找新的位點。Moore等發(fā)現(xiàn)了哺乳動物基因組中的保守微衛(wèi)星位點[10]。Engel等發(fā)現(xiàn)，為某一種偶蹄目(Artiodactyla)動物設計的引物，也可以擴增出其他偶蹄目動物的微衛(wèi)星。例如，他們用牛、山羊和綿羊的微衛(wèi)星位點設計的PCR產物，從旋角羚(Addaxnasomuculatus)等16種?？?Bovidae)動物的345個組織凍存樣中，成功擴增了微衛(wèi)星多態(tài)產物。其他一些研究也證實，對于同屬、科、目中的不同物種也可以使用異種引物擴增微衛(wèi)星，從而大大推動了微衛(wèi)星分析的應用[11]。

2.2 微衛(wèi)星的應用

2.2.1 個體識別

個體識別需要大量的分子標記，其中微衛(wèi)星標記是目前應用的最為廣泛的，因為微衛(wèi)星符合孟德爾遺傳，而且在個體間呈現(xiàn)出較高的多態(tài)性，因此常用來進行個體識別。

2.2.2 性別鑒定

瀕危動物性別的鑒定也是估計該瀕危動物生存力的一個重要指標。如果雌雄性比嚴重失衡，終將影響該瀕危動物的繁殖力，抑或造成嚴重的近交衰退，繼而影響其種群的生存力。Wasser等利用糞便中提取的DNA，通過引物ZFY/X-P1-5EZ，ZFY/X-P1-3EZ，SRY-Y53-3C，SRY-Y53-3D等4對引物成功地鑒定出2只馬來熊(Helarctosmalayanus)的性別為一雌一雄[4]。

2.2.3 親子鑒定

親子鑒定所采用的分子標記種類繁多，如同工酶、AFLP、DNA指紋、微衛(wèi)星等[12]。其中，微衛(wèi)星標記則因其共顯性、高度多態(tài)性、模板量要求低和應用方便等優(yōu)勢，成為了相關領域首選[13]。而親子鑒定所采用的數(shù)理方法則主要有3種[14]：排除法、似然法和基因型重建法。其中排除法根據(jù)孟德爾遺傳定律檢測母親與可疑父本基因型組合能否產生子代基因型，若不能則排除相應可疑父本。似然法則是根據(jù)等位基因頻率計算各非排除父本為親生父本的概率從而確定最大可能父本。而基因型重建較多用于多父本現(xiàn)象存在的物種的種群結構分析中[15]。張于光對東北虎(Pantheratigrisaltaica)微衛(wèi)星DNA遺傳標記引物進行了篩選，并利用篩選出的引物成功地對7對父子關系不明的東北虎進行了鑒定，為東北虎后代繁殖措施的制定提供了有利的依據(jù)[16]。張亞平等用微衛(wèi)星DNA進行圈養(yǎng)大熊貓的親子鑒定，發(fā)現(xiàn)在一雌多雄交配過程中，只有個別雄性個體是有效的。該研究還結合基因型的鑒定，制定了繁殖計劃，防止圈養(yǎng)大熊貓出現(xiàn)近交衰退現(xiàn)象[17]。

2.2.4 家域分析

家域(home range)是動物進行取食、交配、育幼等日?；顒拥膮^(qū)域，對于動物的生存和繁衍、保育和再引種具有重要意義[18-20]。國內外大多數(shù)學者關于有蹄類家域的估算方法多采用最小凸多邊形法(minimum convex polygon，MCP)和內核法(kernel)，基于微衛(wèi)星技術用于物種家域的研究相對較少。Taberlet等通過遺傳學方法獲得的比利牛斯山脈棕熊(Ursusarctospyrenaicus)的家域數(shù)據(jù)與歐洲和北美洲利用無線電跟蹤技術研究的結果一致[21]。Kohn等描述了家域的使用、父權鑒定和親緣關系鑒定都能用糞便基因型的分布和關系模式來推斷[22]。Smith等應用遺傳學和GIS兩種方法評價了胡安捷狐(Vulpesmacrotismutica)糞便微衛(wèi)星DNA結果可靠度的可行性和應用性[23]。

3 擴散生態(tài)學研究

擴散是指個體離開現(xiàn)有的種群或父母種群的行為[24]。擴散所帶來的后果不僅作用于個體適合度，而且影響種群動態(tài)，種群遺傳多樣性和物種分布[25-26]。大量的研究把擴散分為出生擴散(natal dispersal)和繁殖擴散(breeding dispersal)[27]。出生擴散即個體在出生地或社群到繁殖地或繁殖社群之間的永久移動，不管擴散出去的個體繁殖與否；繁殖擴散指繁殖個體在兩個連續(xù)的繁殖群和繁殖社群間移動。擴散會影響種群密度[28]；調節(jié)種群內個體對資源和配偶的競爭壓力；減小種群內個體間近親繁殖的機會，避免近交衰退[29]；影響社群結構和婚配系統(tǒng)[30]；還影響著種群的基因流動，進而影響種群的種群結構和遺傳多樣性[31-32]。

3.1 研究內容及方法

早期人們使用環(huán)志和無線電遙測研究鳥類或獸類的遷移擴散行為。但這些方法的共同弊端在于要捕獲動物。有些動物難于捕獲，捕獲后的重捕率低，這些都對擴散的研究產生不利的影響。而且捕獲和標記易對動物造成損傷，甚至導致動物死亡。近年來，隨著糞便分子生物學在生態(tài)學研究中的廣泛運用，非損傷性取樣也成為研究擴散模式的主要方式[33-34]。分子生物學方法的優(yōu)點不僅在于它能夠獲得大量樣本，以彌補直接方法在樣本量上的不足；更重要的是它能夠探討歷史上的擴散活動對當代種群遺傳結構的影響[35-36]。隨著分子生物學技術的發(fā)展，研究者可以通過同工酶、線粒體DNA、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)、小衛(wèi)星DNA、微衛(wèi)星DNA技術等一些分子標記來研究種群的擴散模式，從而在更大時間尺度上研究物種的擴散[37-38]。分子生物學方法通過比較種群內被捕獲個體和其他個體的遺傳相似度，并結合標記重捕的數(shù)據(jù)對被捕獲個體是否從其他地方遷入做出推測，繼而研究擴散模式[36，39-40]。

3.2 偏性擴散

在主動擴散的鳥類和獸類中，擴散往往存在著性別偏倚，即偏性擴散[41]。了解為什么會發(fā)生偏性擴散仍然是進化生態(tài)學關心的重點。在哺乳動物中有偏雄性擴散的趨勢，而在鳥類中偏雌擴散占大多數(shù)。也有很多反例存在，比如大熊貓[34]、某些靈長類[33]中則為偏雌擴散。在野外精確測量偏性擴散仍然是一個問題，所以很多分子方面的技術及參數(shù)就被用來研究某個物種是否存在著偏性擴散，如Goudet等利用共顯性遺傳標記檢測偏性擴散[42]。

種群內個體間相互作用、近親繁殖的避免、配偶和資源競爭、空間異質性都是引導擴散進化的動力。棲息地的異質性、有限的資源和條件決定的擴散都表明同種個體間、同性成員間，親緣間的競爭在擴散的進化中充當著重要的角色[27]。不同的棲息地質量和社會結構能使空間異質性降低，棲息地的質量不僅體現(xiàn)在資源水平方面，還體現(xiàn)在競爭者的密度、寄生蟲和捕食者。在很多物種中，寄生蟲和捕食者的密度與擴散相關。

4 結語

目前微衛(wèi)星技術在野生動物的保護與管理中應用的越來越多，也得到了一些傳統(tǒng)方法無法得到的研究成果，對于野生動物的遺傳結構分析、譜系圖譜構建、系統(tǒng)分類等都起到了重要的作用，也對一些瀕危物種的遷徙擴散行為進行了一定的研究，但目前國內微衛(wèi)星等分子生物學手段在珍稀瀕危動物的遷徙擴散研究還不是很多，今后若加強這方面的研究，必將對珍稀瀕危動物的保護與管理提供更加可靠的參考依據(jù)。