賀國(guó)強(qiáng) 魏金康 鄧德江* 胡曉艷 吳尚軍 張國(guó)慶

（1北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京100029；2北京農(nóng)學(xué)院，北京102206）

羊肚菌（Morchella）是一種珍稀且美味的食藥兼用菌，于1818年被發(fā)現(xiàn)，在分類(lèi)上隸屬于子囊菌門(mén)、子囊菌綱、盤(pán)菌目、羊肚菌科、羊肚菌屬。全球范圍內(nèi)羊肚菌被視為珍貴的食用菌，是我國(guó)重要的出口食用菌產(chǎn)品之一。

羊肚菌分布范圍較為廣泛，世界上記載的羊肚菌共有28個(gè)種[1]，分布于亞洲、歐洲、北美洲及大洋洲的一些地區(qū)。其中我國(guó)記載羊肚菌屬有11個(gè)種[2]，分別為：黑脈羊肚菌（Morchella angusticeps）、肋脈羊肚菌（Morchella costata）、粗腿羊肚菌（Morchella crassipes）、小羊肚菌（Morchella deliciosa）、高羊肚菌（Morchella elata）、高羊肚菌紫褐變種（Morchella elata var.purpurascens）、羊肚菌（Morchella esculenta）Pers.））、羊肚菌堅(jiān)挺變種（Morchella esculenta var.rigida）、羊肚菌褐赭色變種（Morchella esculenta var.umbrina）、薄棱羊肚菌（Morchella miyabeana）、普通羊肚菌（Morchella vulgaris）。

羊肚菌的馴化栽培最早始于法國(guó)，距今已有130余年的歷史[3]。1982年美國(guó)的Ron Ower等首次獲得了室內(nèi)栽培形成的羊肚菌子實(shí)體[4]，隨后美國(guó)利用工廠進(jìn)行了數(shù)年的羊肚菌產(chǎn)業(yè)化栽培，但由于某些原因以失敗告終。本世紀(jì)初我國(guó)也成功實(shí)現(xiàn)了人工栽培羊肚菌，并開(kāi)創(chuàng)了羊肚菌大田栽培模式，對(duì)于羊肚菌產(chǎn)業(yè)化有重要意義。

根據(jù)菌蓋近中部與菌柄是否分離、菌蓋邊緣是否明顯向外伸展、菌蓋的形狀和顏色、蓋表棱紋排列和凹坑的深淺等特征，羊肚菌屬分為3個(gè)大類(lèi)：黑色羊肚菌類(lèi)、黃色羊肚菌類(lèi)和半開(kāi)羊肚菌類(lèi)。目前我國(guó)可以人工栽培的羊肚菌基本均屬于黑色羊肚菌類(lèi)，例如尖頂羊肚菌、羊肚菌[5，6]等。杜習(xí)慧等研究表明，由于環(huán)境和氣候等外界條件的變化會(huì)導(dǎo)致羊肚菌子囊果的形狀、大小、顏色的改變，甚至同一物種不同發(fā)育階段，其形態(tài)特征都有較大變化，例如梯紋羊肚菌不同發(fā)育階段的形態(tài)存在較大差異[7]。加之不同環(huán)境條件下，水分、空氣濕度、光線強(qiáng)弱等均會(huì)對(duì)羊肚菌的形態(tài)產(chǎn)生不同的影響，造成同一品種菇形差異較大。因此僅從形態(tài)特征上難以準(zhǔn)確鑒定羊肚菌的種類(lèi)，還需以分子標(biāo)記加以輔助。Du通過(guò)對(duì)我國(guó)羊肚菌系統(tǒng)發(fā)育研究，發(fā)現(xiàn)中國(guó)有30種羊肚菌，其中有20個(gè)為本地種，9個(gè)種在歐洲也有分布，4個(gè)種可能是火燒適應(yīng)種[8]。王波和鮮靈對(duì)四川地區(qū)人工栽培的羊肚菌進(jìn)行了形態(tài)特征描述和ITS rDNA序列分析，表明該地人工栽培羊肚菌均為梯紋羊肚菌（Morchella importuna）[9]。

筆者對(duì)北京地區(qū)栽培的羊肚菌進(jìn)行了采集和分析，以期確定北京栽培羊肚菌的種類(lèi)。

1 材料與方法

1.1 菌株分離、培養(yǎng)與保存

羊肚菌新鮮子實(shí)體分別采集自北京懷柔、昌平等地人工栽培的新鮮菌子囊果，商品菌株編號(hào)分別為2022、黑脈、羊朱164。菌株純培養(yǎng)的分離采用組織分離法，三個(gè)商品菌株分別對(duì)應(yīng)YD1701、YD1702和YD1703。菌株于25℃培養(yǎng)，4℃保存。

1.2 形態(tài)特征鑒定方法

對(duì)羊肚菌子實(shí)體進(jìn)行了子實(shí)體的外觀形態(tài)和顯微形態(tài)特征觀察，記錄形態(tài)特征。

1.3 基于ITS序列分析的分類(lèi)學(xué)鑒定

1.3.1 基因組DNA提取方法

圖1 人工栽培的3個(gè)品種羊肚菌子囊果的形態(tài)特征（從左至右為羊朱164、2022、黑脈羊肚菌）

以PDA平板上生長(zhǎng)的新鮮菌絲體為材料，無(wú)菌條件下刮取，以DNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取基因組DNA。

1.3.2 ITS序列分析

ITS部分序列PCR擴(kuò)增以真菌ITS通用引物ITS1和 ITS4，PCR 反應(yīng)體系 50 μL。反應(yīng)體系為50 μL，該體系包括2×PCR Master Mix 25 μL，Primer（0.2 μmol/L）各1.5 μL；模板DNA 1 μL，加ddH2O 補(bǔ)齊至50 μL。在BioRad My Cycle型PCR儀上擴(kuò)增，PCR程序設(shè)定 94℃，3 min（預(yù)變性）；94℃變性1 min，54℃下退火1 min72℃，延伸2 min；共計(jì)30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后在72℃延伸8 min。

1.3.3 測(cè)序

將ITS-PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，操作方法依試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行，純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和引物直接測(cè)序，測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3.4 ITS序列分析

測(cè)序結(jié)果利用BLAST在線比對(duì)工具進(jìn)行序列分析，并根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載羊肚菌屬多個(gè)種的ITS序列，使用Mega 6.0軟件中NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹(shù)，分析同源關(guān)系，分析分類(lèi)學(xué)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 子實(shí)體形態(tài)特征

對(duì)采集自北京懷柔區(qū)和昌平區(qū)的人工栽培的羊肚菌進(jìn)行了形態(tài)特征描述，采集的3個(gè)羊肚菌樣品在子實(shí)體形態(tài)特征上無(wú)明顯區(qū)別（圖1）。羊肚菌子實(shí)體菌蓋為灰黑色、錐形，縱棱排列較規(guī)則，橫棱不規(guī)則，縱棱和橫棱交接形成似梯子狀的橫隔，凹坑深。菌蓋長(zhǎng)8～10 cm，直徑2.3～2.8 cm；菌蓋與菌柄離生，菌蓋中空，菌柄柱狀，基部稍膨大，中空，白色；菌柄長(zhǎng)度3.5～4.0 cm，直徑1.0～1.3 cm。子囊棒狀，無(wú)色，每個(gè)子囊內(nèi)有8個(gè)子囊孢子，縱向或重疊排列，大小為（160～200）μm×（16～20）μm；側(cè)絲棒狀，頂端膨大，大小為（80～110）μm×（7～10）μm；子囊孢子橢圓形，無(wú)色，大小為（10～16）μm×（7～12）μm。

2.2 ITS擴(kuò)增

對(duì)3個(gè)羊肚菌種樣品進(jìn)行基因組DNA提取后，通過(guò)ITS1、ITS4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢驗(yàn)，產(chǎn)物測(cè)序獲得YD1701、YD1702和YD1703菌株部分ITS序列，長(zhǎng)度分別為720 bp、717 bp和716 bp。

2.3 羊肚菌屬的系統(tǒng)發(fā)育分析

采用Neighbor-Joining法構(gòu)建3個(gè)羊肚菌和GenBank中下載的21個(gè)羊肚菌屬種的基于ITS系列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀圖（圖2）。待鑒定的羊肚菌3個(gè)樣品與Morchella importuna在同一個(gè)分枝上，其序列系相似性為99%，除Morchella sextelata外，與其它羊肚菌屬的6個(gè)種在不同分枝上。當(dāng)序列相似性≥99%時(shí)，為相同物種，因此，待鑒定的3個(gè)人工栽培羊肚菌應(yīng)為梯紋羊肚菌Morchella importuna。

圖2 3個(gè)羊肚菌樣品的ITS電泳圖譜

3 討論與結(jié)論

圖3 基于羊肚菌ITS rDNA序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

近幾年，羊肚菌人工栽培已取得成功，并且在四川、重慶、湖北等地大面積栽培。2016年全國(guó)人工栽培羊肚菌突破1533.3 hm2，發(fā)展較為迅猛。由于早期缺乏分子標(biāo)記的證據(jù)，不同條件下人工栽培的羊肚菌子囊果個(gè)體間差異較大，難以根據(jù)系統(tǒng)特性加以鑒定，最早利用仿生栽培的羊肚菌被認(rèn)為是尖頂羊肚菌[5，10]。筆者將北京大面積栽培的羊肚菌ITS rDNA序列與GenBank中羊肚菌序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)北京人工栽培的羊肚菌為梯紋羊肚菌M.importuna。這與王波、杜習(xí)慧的報(bào)道一致[7，9]。而何培新等的研究表明，目前我國(guó)大面積種植的羊肚菌分別為梯紋羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌[11]。

北京人工栽培的羊肚菌物種鑒定為梯紋羊肚菌，可能由于引種的原因，來(lái)源于四川，也可能由本地的野生羊肚菌馴化而來(lái)。目前，可以栽培的羊肚菌并不局限于梯紋羊肚菌。如在美國(guó)分布并實(shí)現(xiàn)人工栽培的變紅羊肚菌M.rufobrunnea。在我國(guó)云南等地尖頂羊肚菌也被用于仿生栽培獲得，但未見(jiàn)按照大田栽培模式的報(bào)道。因此，科研人員可以擴(kuò)大羊肚菌種質(zhì)資源的收集，加大野生羊肚菌的馴化栽培，或許可以篩選出可栽培的羊肚菌新種類(lèi)。

研究結(jié)果表明，相對(duì)于其他主產(chǎn)區(qū)，北京地區(qū)目前大面積栽培的羊肚菌種類(lèi)比較單一，為梯紋羊肚菌M.importuna。