趙鵬程，楊 棟，任 樂，何朝宏

(河南省腫瘤醫(yī)院,鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，河南鄭州 450003)

前列腺癌是常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1]，西方發(fā)達國家前列腺癌的發(fā)病率和死亡率較高，據(jù)文獻資料統(tǒng)計，2013年美國前列腺癌新增病例約為24萬、死亡人數(shù)約為3萬人，2012年我國腫瘤登記地區(qū)前列腺癌的發(fā)病率為9.92/10萬，居于男性惡性腫瘤的第6位[2]，還有研究表明，預計到2050年前列腺癌的發(fā)病率將增加2.5倍[3]，嚴重威脅男性患者身體健康和生命安全。前列腺癌具有遠端轉(zhuǎn)移和浸潤生長的特性，嚴重影響患者的生存率，因此，采取有效的措施抑制癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是治療前列腺癌的重要環(huán)節(jié)。Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitory protein，RKIP)是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因[4]，有研究表明，RKIP與子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。然而，RKIP對前列腺癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響及相關(guān)機制的研究還較少，本研究以人前列腺癌細胞系PC3為研究對象，探究RKIP對前列腺癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移及磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol kinase，PI3K)/蘇氨酸蛋白激酶(threonine protein kinase，Akt)/核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor-kB，NF-kB)通路的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標本及細胞系 隨機選取2015年5月至2017年5月在河南省腫瘤醫(yī)院行根治性切除術(shù)的前列腺癌組織標本及對應癌旁前列腺組織標本各103例，術(shù)后經(jīng)組織病理檢查均確認為前列腺腺癌患者。人前列腺癌細胞系PC3購自美國ATCC公司。

1.1.2主要試劑與儀器 改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；TrIzol 試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量試劑盒購自英國NEB公司；鼠抗人PI3K、Akt、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated Akt，p-Akt)和NF-kB多克隆抗體購自艾比瑪特醫(yī)藥科技(上海)有限公司；48孔細胞培養(yǎng)板和transwell小室購自美國Corning公司；基質(zhì)膠購自美國BD公司；超低溫離心機(型號3K15)購自德國Sigma公司；奧林巴斯熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；熒光定量PCR儀器購自德國Eppendorf；脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)序列和目標載體由蘇州金唯智生物科技有限公司合成、構(gòu)建。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將購買的人前列腺癌細胞PC3解凍復蘇，接種于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長滿瓶底85%左右時，棄去培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶消化處理后，進行傳代培養(yǎng)和細胞凍存。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染及分組 取對數(shù)期人前列腺癌細胞PC3接種于48孔細胞培養(yǎng)板(100 μL/孔)，待細胞融合度達到85%以上時，用胰蛋白酶消化處理后，按照Lipofectainine2000轉(zhuǎn)染劑說明書將購買的pcDNA3.0-RKIP、pcDNA3.0、RKIP-shRNA和shRNA-NC轉(zhuǎn)染至前列腺癌細胞，命名為pcDNA3.0-RKIP組、pcDNA3.0組、RKIP-shRNA組、shRNA-NC組，每組重復9孔，以未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞作為對照組，對照組加入等量的二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，各組細胞均培養(yǎng)48 h。

1.2.3實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR)檢測人前列腺癌細胞PC3中RKIP mRNA表達水平 用TrIzol 試劑提取人前列腺癌細胞PC3的總RNA，并將其反轉(zhuǎn)成cDNA，根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)上提交的RKIP的理論序列設(shè)計引物，RKIP：上游引物F1，5′-TTGGTGGTGAATATGAAAGG-3′，下游引物R1，5′-TAAGAGTCGTTGGCGAGT-3′；3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物F2，5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物R2，5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′；以GAPDH為內(nèi)參進行qRT-PCR。反應體系：5×緩沖液 5 μL，TaqDNA聚合酶 0.5 μL，上游引物F 1 μL，下游引物R 1 μL，10 mmol/L脫氧核苷三磷酸混合液(deoxyriboNucleotide triphosphate mix，dNTP mix)0.5 μL，互補DNA(complementary DNA，cDNA)1 μL，滅菌蒸餾水 16 μL；反應條件：預變性：95 ℃ 5 min，變性：95 ℃ 30 s，延伸：62℃ 15 s，40個循環(huán)，采用最大二階導數(shù)法(2-△△Ct)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，計算RKIP mRNA的相對表達量。

1.2.4Transwell小室檢測人前列腺癌細胞PC3侵襲能力 用DMEM無血清培養(yǎng)基將Matrigel膠稀釋至1 mg/mL，然后取40 μL均勻鋪于transwell小室，37℃靜置30 min。取各組人前列腺癌細胞PC3消化處理后制成單細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)目為1×106/mL，按每孔100 μL加入到transwell小室，常規(guī)培養(yǎng)48 h后取出小室，棄去培養(yǎng)液，用磷酸緩沖液(phosphatic buffer solution，PBS)溶液清洗細胞，每孔加入500 μL 95%乙醇固定15～20 min，經(jīng)0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min后，用棉簽擦拭未穿膜細胞，風干后置于顯微鏡觀察，并記錄穿膜細胞數(shù)目，以此作為評判細胞侵襲能力的指標。

1.2.5劃痕實驗檢測人前列腺癌細胞PC3遷移能力 將各組人前列腺癌細胞PC3制成單細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)目為1×106/ mL接種于細胞培養(yǎng)板(100 μL/孔)，培養(yǎng)24 h，細胞密度達80%時，用滅菌過的200 μL槍頭劃線，用PBS洗去劃痕中的細胞，加入空白培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，置于倒置顯微鏡下觀察發(fā)生遷移的細胞數(shù)目。

1.2.6Western blot檢測RKIP、PI3K、Akt、p-Akt及NF-kB表達情況 分別加入細胞裂解液提取人前列腺癌組織、癌旁組織蛋白及人前列腺癌細胞PC3總蛋白，將蛋白樣品進行加熱煮沸和離心。以GAPDH為內(nèi)參，取20 μL蛋白質(zhì)樣品，進行十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel，PAGE)，電泳結(jié)束后，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜50 min，滴加鼠抗人RKIP、PI3K、Akt、NF-kB多克隆抗體，置于4℃下過夜，滴加二抗37℃放置1 h。采用電化學發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)分析法，加入ECL發(fā)光劑進行顯影，利用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。采用Image J 軟件對 Western blot 條帶進行灰度分析。

1.3統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1RKIP在前列腺癌組織表達情況前列腺癌組

織RKIP蛋白相對表達為(0.64±0.11)顯著低于癌旁組織(1.12±0.22)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2轉(zhuǎn)染后人前列腺癌細胞PC3中RKIPmRNA和蛋白表達水平shRNA-NC組和pcDNA3.0組PC3細胞中RKIP mRNA和蛋白表達水平與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，RKIP-shRNA組PC3細胞中RKIPmRNA和蛋白表達水平顯著低于對照組和shRNA-NC組(P<0.05)，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞中RKIP mRNA和蛋白表達水平顯著高于對照組和pcDNA3.0組(P<0.05)，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞中RKIP mRNA和蛋白表達水平顯著高于RKIP-shRNA組(P<0.05，表1、圖1)。

組別RKIPmRNA蛋白對照組0.68±0.120.71±0.08shRNA-NC組0.70±0.140.66±0.13RKIP-shRNA組0.48±0.08*#0.31±0.09*#pcDNA3.0組0.66±0.150.64±0.12pcDNA3.0-RKIP組0.97±0.18*△&0.93±0.11*△&

RKIP：Raf激酶抑制蛋白。與對照組相比，*P<0.05；與shRNA-NC組相比，#P<0.05；與pcDNA3.0組相比，△P<0.05；與RKIP-shRNA組相比，&P<0.05。

圖1 各組人前列腺癌細胞PC3中RKIP 表達水平

A:各組RKIP mRNA相對表達水平；B:各組RKIP蛋白相對表達水平；C:轉(zhuǎn)染后人前列腺癌細胞PC3中RKIP蛋白表達情況。RKIP：Raf激酶抑制蛋白；GAPDH:3-磷酸甘油醛脫氫酶。與對照組相比，*P<0.05；與shRNA-NC組相比，#P<0.05；與pcDNA3.0組相比，△P<0.05；與RKIP-shRNA組相比，&P<0.05。

2.3transwell小室檢測人前列腺癌細胞PC3侵襲能力shRNA-NC組和pcDNA3.0組PC3細胞侵襲能力與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，RKIP-shRNA組PC3細胞侵襲能力顯著高于對照組和shRNA-NC組(P<0.05)，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞侵襲能力顯著低于對照組和pcDNA3.0組(P<0.05)，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞侵襲能力顯著低于RKIP-shRNA組(P<0.05，表2、圖2)。

組別侵出細胞數(shù)目(個)對照組135.12±21.32shRNA-NC組146.37±23.41RKIP-shRNA組476.45±53.72*#pcDNA3.0組128.67±21.24pcDNA3.0-RKIP組 84.27±22.82*△&

圖2 transwell小室檢測人前列腺癌細胞PC3侵襲能力(×400)

2.4劃痕實驗檢測人前列腺癌細胞PC3遷移能力shRNA-NC組和pcDNA3.0組PC3細胞遷移能力與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，RKIP-shRNA組PC3細胞遷移能力顯著高于對照組和shRNA-NC組(P<0.05)，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞遷移能力顯著低于對照組和pcDNA3.0組(P<0.05)，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞遷移能力顯著低于RKIP-shRNA組(P<0.05，表3、圖3)。

2.5Westernblot檢測PC3細胞中PI3K、Akt及NF-kB表達情況各組間Akt的表達水平相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。shRNA-NC組和pcDNA3.0組PC3細胞中PI3K、p-Akt和NF-kB的表達水平與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，RKIP-shRNA組PC3細胞中PI3K、p-Akt和NF-kB的表達水平顯著高于對照組和shRNA-NC組(P<0.05)，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞中PI3K、p-Akt和NF-kB的表達水平顯著低于對照組和pcDNA3.0組(P<0.05)，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞中PI3K、p-Akt和NF-kB的表達水平顯著低于RKIP-shRNA組(P<0.05，圖4、表4)。

組別發(fā)生遷移的細胞數(shù)目(個)對照組432.46±68.52shRNA-NC組457.36±52.34RKIP-shRNA組942.38±154.28*#pcDNA3.0組405.56±58.37pcDNA3.0-RKIP組116.52±21.34*△&

與對照組相比，*P<0.05；與shRNA-NC組相比，#P<0.05；與pcDNA3.0組相比，△P<0.05；與RKIP-shRNA組相比，&P<0.05。

圖3 細胞劃痕實驗檢測人前列腺癌細胞PC3遷移能力(×400)

組別PI3KAktp-AktNF-kB對照組0.58±0.120.62±0.110.64±0.120.72±0.13shRNA-NC組0.61±0.100.59±0.100.62±0.130.69±0.15RKIP-shRNA組0.83±0.17*#0.60±0.120.86±0.20*#0.95±0.23*#pcDNA3.0組0.56±0.130.63±0.110.66±0.130.74±0.14pcDNA3.0-RKIP組0.41±0.07*△&0.57±0.100.41±0.08*△&0.51±0.10*△&

PI3K：磷脂酰肌醇激酶；Akt：蘇氨酸蛋白激酶；NF-kB：核轉(zhuǎn)錄因子。與對照組相比，*P<0.05；與shRNA-NC組相比，#P<0.05；與pcDNA3.0組相比，△P<0.05；與RKIP-shRNA組相比，&P<0.05。

圖4 Western blot檢測PC3細胞中PI3K、Akt、p-Akt和NF-kB表達情況

3 討 論

前列腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，可發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移和浸潤生長，侵襲膀胱和精囊，引起陽痿、血尿、血精等癥狀[6]，前列腺癌還會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，進而導致骨痛、骨折或截癱[7]，嚴重影響患者的身體健康，因此，采取有效的措施抑制前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是治療前列腺癌的重要環(huán)節(jié)。RKIP作為磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP)家族中一個成員，能夠與Raf結(jié)合抑制其激活[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織RKIP蛋白相對表達顯著低于癌旁組織，且前列腺癌PC3細胞中RKIP蛋白表達顯著低于正常細胞，提示RKIP在前列腺癌中可能為抑癌基因。另有研究表明，RKIP與細胞增殖和侵襲密切相關(guān)[9]。張曉梅等[10]研究表明，上調(diào)胃癌細胞SGC7901中RKIP基因表達，能夠抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，并促進胃癌細胞凋亡。褚靜等[11]研究表明，上調(diào)宮頸癌細胞RKIP基因的表達，能夠抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，是宮頸癌治療的新靶點。為進一步明確RKIP在前列癌疾病進展中作用，本研究采用RKIP表達較低的PC3細胞作為研究載體，分別用RKIP-shRNA和pcDNA3.0-RKIP轉(zhuǎn)染PC3細胞，結(jié)果表明，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞RKIP mRNA表達水平顯著高于RKIP-shRNA組和對照組，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞侵襲和遷移能力顯著低于RKIP-shRNA組和對照組，表明上調(diào)PC3細胞RKIP基因的表達，能夠抑制前列腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，與張曉梅等[10]在胃癌細胞中研究一致，但其機制尚不清楚。

RKIP的表達水平與生物體中重要的信號通路密切相關(guān)[12]。PI3K/Akt是生物體內(nèi)重要的信號通路，其活性涉及多個基因的調(diào)控，參與腫瘤細胞的增殖、遷移、凋亡等過程[13]。黃海等[14]研究表明，激活前列腺癌細胞LNcap中PI3K/Akt信號通路的活性能夠促進前列腺癌細胞的增殖，并抑制前列腺癌細胞凋亡。賈艷菊等[15]研究表明，抑制前列腺癌細胞中PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路，能夠抑制前列腺癌細胞的生長、增殖以及分化。NF-kB是PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路下游的關(guān)鍵蛋白，與細胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。BUFU等[16]研究表明，南蛇藤酮可通過抑制PI3K/Akt 信號通路活性抑制直腸癌細胞MMP蛋白表達，進而抑制細胞增殖和遷移能力，促進細胞凋亡。CHIU 等[17]研究表明，下調(diào)前列腺癌細胞中Akt/NF-kB信號通路活性，能夠抑制人前列腺癌細胞的侵襲。LIU等[18]發(fā)現(xiàn)，RKIP過表達可顯著抑制NF-kB通路的激活，增強胃癌細胞對順鉑的敏感性。本研究顯示，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞中PI3K、p-Akt和NF-kB的表達水平顯著低于RKIP-shRNA組，表明RKIP過表達能夠抑制PI3K/Akt/NF-kB信號通路的活性，提示RKIP過表達對前列腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用可能與抑制PI3K/Akt/NF-kB信號通路激活有關(guān)。

綜上所述，RKIP過表達能夠抑制前列腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，可能通過抑制PI3K/Akt/NF-kB通路激活實現(xiàn)，為前列腺癌的靶向治療提供一定的理論依據(jù)。