陳景林，陳錦濤，陳利武，曾今誠(chéng)

(1.廣東省汕頭市潮陽(yáng)區(qū)大峰醫(yī)院，廣東汕頭 515100；2.廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 523808)

膀胱癌常見(jiàn)且治愈困難、死亡率高，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移更是會(huì)威脅到人的生命健康[1]。近些年膀胱癌發(fā)病率一直居高不下[2]。手術(shù)治療在早期患者的治療中具有較好的療效；但晚期以及術(shù)后復(fù)發(fā)的膀胱癌患者，常采用化療，但所使用的藥物昂貴、毒副作用大，患者身體痛苦程度高、心理壓力大，治療效果并不顯著[3]。近期研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素(rapamycin，RPM)又名西羅莫司(sirolimus)在膀胱癌的治療具有明確療效[4]。而本研究引入超聲微泡造影技術(shù)，進(jìn)一步分析RPM對(duì)膀胱癌的治療機(jī)制以及超聲微泡造影技術(shù)應(yīng)用在膀胱癌的治療當(dāng)中的意義，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞培養(yǎng)材料：人膀胱癌T24細(xì)胞株、細(xì)胞凍存培養(yǎng)基(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清分別購(gòu)自上海弘順生物科技有限公司、上海源葉生物科技有限公司和美國(guó)Thermo Fisher公司；藥物RPM購(gòu)自美國(guó)Biomil公司；檢測(cè)試儀器和試劑：流式細(xì)胞儀和酶標(biāo)儀分別購(gòu)自美國(guó)Coulter公司和MD公司，四甲基偶氮唑鹽法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)反應(yīng)試劑和超聲造影劑Bracco SonoVue(規(guī)格59 mg)分別購(gòu)自購(gòu)自北京賽因坦科技有限公司、TaKaRa Corporation和美國(guó)Sigma 公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組培養(yǎng) 在RPMI-1640 培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，并將T24細(xì)胞置于上述培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。分組：將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、RPM組和超聲微泡造影劑攜RPM組。① 對(duì)照組：接種細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，不做任何處理，堅(jiān)持每天換液；② RPM組：接種細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，加入RPM 100 ng/mL；③ 超聲微泡造影劑攜RPM組：接種細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，加入RPM 100 ng/mL的同時(shí)應(yīng)用超聲輻射。將超聲照射時(shí)間、輻照聲強(qiáng)、超聲頻率三項(xiàng)超聲參數(shù)分別設(shè)定為10 s、0.5 W/cm2和300 kHz后，固定超聲探頭于24孔板底部進(jìn)行超聲照射，后加入RPM 100 ng/mL[5]。超聲造影劑Bracco SonoVue和RPM分別用適量生理鹽水和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，-20 ℃保存。

1.2.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用MTT比色法進(jìn)行。胰蛋白酶消化處理后的對(duì)數(shù)期T24細(xì)胞按照每孔1 000個(gè)細(xì)胞(150 μL)接種于96孔板，相同條件下孵育24 h后棄去培養(yǎng)液。按照“1.2.1項(xiàng)”下不同組別的處理方案繼續(xù)操作，每組細(xì)胞均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)溫育24 h后取出進(jìn)行MTT比色分析。具體操作如下：各孔加入四甲基偶氮唑鹽(MTT)(5 mg/mL)20 μL，培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液；每孔加DMSO 150 μL，避光搖晃混勻，室溫放置15 min，采用酶標(biāo)儀于500 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)值，重復(fù)操作3次。

1.2.3細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 胰蛋白酶消化處理后的T24細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶(106個(gè)細(xì)胞)中，按照“37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h→4 ℃培養(yǎng)2 h”的順序進(jìn)行。棄去培養(yǎng)液后按照“1.2.1項(xiàng)”下不同組別的處理方案繼續(xù)操作，3組細(xì)胞分別加入培養(yǎng)液、100 nmol/L RPM和100 nmol/L RPM各3 mL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后采用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗3次。向胰蛋白酶消化處理后T24細(xì)胞中加入2 mL枸櫞酸溶液，經(jīng)過(guò)“緩沖液沖洗2次→75%乙醇固定”操作程序后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期；按照“加PBS緩沖液→Annexin V室溫避光30 min→加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)→避光反應(yīng)10 min→加緩沖液”操作步驟后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率和死亡率。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)檢測(cè)3次。

1.2.4逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原mRNA表達(dá)水平 增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的mRNA表達(dá)采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reversed transcript polymerase chain reaction，RT-PCR)法。接種細(xì)胞至6 孔板，每孔2 mL，3組細(xì)胞根據(jù)“1.2.1項(xiàng)”下處理方案繼續(xù)操作，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，提取細(xì)胞總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用滅菌去離子水配置20 μ mol/L PCR反應(yīng)引物，按照表1中PCR反應(yīng)儀擴(kuò)增步驟操作，其中第1～4步循環(huán)28次后72 ℃ 10 min終止反應(yīng)。取PCR 產(chǎn)物5 μL，經(jīng)20 g/L 瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL 溴化乙啶) 電泳，紫外成像后采用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)處理。結(jié)果以內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的吸光度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正后分析(表1)。

表1PCR反應(yīng)儀增步驟

序號(hào)步驟溫度(℃)時(shí)間1預(yù)變性943 min2變性9430 s3退火5430 s4延伸7230 s5終止7210 min

1.2.5Western blot測(cè)定PCNA的蛋白表達(dá)水平 采用Western blot測(cè)定PCNA的蛋白水平表達(dá)。將待測(cè)細(xì)胞裂解后，二喹啉甲酸(bicinchonic acid，BCA)法蛋白定量試劑盒定量，加入上樣緩沖液混勻后加熱變性；取等量蛋白進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)電泳分離，恒流300 mA 60 min 轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，電化學(xué) (electrochemiluminescence，ECL) 發(fā)光，拍照存檔。

表2PCR引物序列

目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物(bp)上游引物序列(5'～3')下游引物序列(5'～3')PCNA412GTGACTGGTTATCGTCCCTCCTTCAGCATTATCTTCAGCCCTTAGAPDH307CT CTGGAAAGCTGTGGCGTGATGGAAGAATGGGAGTTGCTGTTG

PCNA：增殖細(xì)胞核抗原；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)從本次研究對(duì)象中獲得的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行整理歸納，并采用SPSS19.0軟件t檢測(cè)對(duì)3組T24細(xì)胞增值、凋亡以及PCNA的mRNA及蛋白表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和比較，其中P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1超聲微泡造影劑攜RPM對(duì)T24細(xì)胞增殖的影響對(duì)照組、RPM組和超聲微泡造影劑攜RPM組3組細(xì)胞的生長(zhǎng)能力分別為1.065±0.026、0.816±0.021和0.512±0.013，可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)RPM和超聲微泡造影劑攜RPM處理過(guò)后的T24細(xì)胞生長(zhǎng)能力明顯下降，其中超聲微泡造影劑攜RPM組與空白對(duì)照組、RPM組存在顯著差異(P<0.05)。

2.2超聲微泡造影劑攜RPM對(duì)T24細(xì)胞周期分布與凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明經(jīng)RPM和超聲微泡造影劑攜RPM處理過(guò)后的處于G1期的T24細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，并且T24細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡(表3，圖1)。

組別G0/G1SG1/M對(duì)照組72.5± 1.3520.73±0.966.93±0.31RPM組75.2±1.5718.02±0.814.78±0.27超聲微泡造影劑攜RPM組78.9±1.8212.32±0.782.28±0.11

圖1RPM處理、超聲微泡造影劑攜RPM細(xì)胞影響的流式細(xì)胞儀周期檢測(cè)結(jié)果

A：RPM處理；B：超聲微泡造影劑攜RPM。

圖2 PCNA-mRNA RT-PCR 產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖

1：250bp和500 bp DNA條帶；2:對(duì)照組PCNA和GAPDH mRNA 表達(dá)情況(上面為PCNA，下面為GAPDH)；3、4：RPM以及超聲微泡造影劑攜RPM處理后mRNA 表達(dá)情況。

3 討 論

超聲微泡造影劑是一種新型超聲應(yīng)用材料，有助于腫瘤的早期診斷及靶向治療，在膀胱腫瘤臨床應(yīng)用中較為普遍[6]。主要是應(yīng)用高靈敏度、高分辨率的實(shí)時(shí)超聲造影對(duì)膀胱腫瘤的形態(tài)、大小及腫瘤浸潤(rùn)程度進(jìn)行檢查和診斷[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度超聲可以崩解納米微泡從而增加細(xì)胞膜的通透性，為膀胱癌的靶向治療提供依據(jù)[8]。RPM屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，最早20世紀(jì)80年代便作為一種新型免疫抑制劑并應(yīng)用于器官移植后的免疫排斥反應(yīng)的治療方面[9]。近些年多項(xiàng)研究表明，RPM可以通過(guò)作用于哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)而抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種作用[10]。因此，本課題重點(diǎn)研究超聲微泡造影劑攜RPM在膀胱癌治療當(dāng)中的優(yōu)勢(shì)以及作用機(jī)制，為臨床上進(jìn)一步的研究和應(yīng)用提供有力依據(jù)。

郭賀豐等[11]研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素能夠明顯抑制PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)能力，其抑制能力與作用時(shí)間和藥物濃度呈現(xiàn)依賴性，同時(shí)也可以抑制PC-3細(xì)胞的分裂和增值；單廣夷等[12]研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素對(duì)T24 細(xì)胞的增殖抑制作用和體外細(xì)胞侵襲能力的抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴性。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)RPM處理后的RPM組T24細(xì)胞的細(xì)胞增值能力下降，出現(xiàn)大量凋亡，多數(shù)細(xì)胞增殖停滯在G1期，與上述研究結(jié)果具有一定程度的相似性。其主要原因是RPM進(jìn)入細(xì)胞后通過(guò)與基質(zhì)中小分子蛋白結(jié)合成復(fù)合物，進(jìn)一步結(jié)合mTOR，阻斷mTOR通路，切斷增殖信號(hào)，控制mTOR介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞G1-S期的增殖，從而使大部分細(xì)胞周期停滯在G1期，最終阻礙腫瘤細(xì)胞的增殖[13]。PCNA 作為DNA 多聚酶δ的輔助亞單位，在細(xì)胞分裂過(guò)程DNA的合成過(guò)程中發(fā)揮輔助作用，可作為細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，RPM處理過(guò)后的RPM組的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯下降，可見(jiàn)細(xì)胞增殖也處于一個(gè)停滯階段，腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)并不活躍。王建波等發(fā)現(xiàn)雷帕霉素在大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌瘤細(xì)胞PCNA-mRNA 的表達(dá)過(guò)程當(dāng)中發(fā)揮抑制作用，其抑制能力隨藥物濃度增高其抑制作用增強(qiáng)，進(jìn)一步佐證了上述結(jié)果。

另外，超聲微泡造影劑攜RPM組細(xì)胞用MTT法測(cè)定的T24細(xì)胞增長(zhǎng)水平明顯低于RPM組，以及凋亡情況明顯高于RPM(P<0.05)；相對(duì)于RPM組，其PCNA的mRNA及蛋白的表達(dá)情況也明顯較低(P<0.05)，可見(jiàn)，超聲微泡造影劑能夠增強(qiáng)RPM對(duì)于膀胱腫瘤細(xì)胞的抑制效果，分析其主要原因在于超聲微泡造影劑在一定能量的超聲波輻照下，微泡可以通過(guò)機(jī)械機(jī)制、空化機(jī)制、熱機(jī)制而發(fā)生“快速膨脹—收縮—破裂”一系列的變化，增加細(xì)胞膜通透性，從而使造影劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的RPM更加廣泛、快速而準(zhǔn)確的發(fā)揮作用，從而抑制膀胱癌T24細(xì)胞的增殖情況[15-16]。

綜上所述，超聲微泡造影劑攜RPM相較于單獨(dú)應(yīng)用RPM作用效果更加明顯，能夠使藥物準(zhǔn)確且快速的發(fā)揮療效，從而抑制膀胱腫瘤T24細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖；并通過(guò)與mTOR蛋白的作用而使得大部分細(xì)胞停滯在G1期，加快細(xì)胞的凋亡。超聲微泡造影劑攜RPM在膀胱癌的治療當(dāng)中具有很好的臨床應(yīng)用前景。