豬場(chǎng)疫苗免疫效果監(jiān)測(cè)評(píng)估

張愛(ài)瓊 ，曾智勇，梁海英，王 彬，咸 文，何小莉，陳 娟，吳好葉，黃二素

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

1 死亡率和日增重

死亡率和日增重是豬場(chǎng)疫苗免疫效果檢驗(yàn)中重要的指標(biāo)，是指在疫苗免疫后的相同時(shí)間間隔內(nèi)對(duì)免疫豬只的死亡率和日增重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，是免疫后對(duì)疫苗效果檢驗(yàn)的重要手段之一。李軍[1]設(shè)計(jì)7組試驗(yàn)，每組22頭體重差異不大的仔豬，1～5組為試驗(yàn)免疫組，剩余6～7組為空白對(duì)照組，在首次免疫后隨著日齡的增加，組間差異增大，試驗(yàn)免疫組較空白對(duì)照組日增重差異顯著，疫苗免疫對(duì)豬只的保護(hù)最終優(yōu)化了料重比。

2 PCR檢測(cè)法

PCR檢測(cè)方法是一種DNA體外擴(kuò)增法，在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可以對(duì)病毒DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，以檢測(cè)豬只感染所產(chǎn)生的病毒血癥。李長(zhǎng)海等[2]使用PCV2亞單位疫苗和PCV2全病毒滅活疫苗將1 000頭仔豬分3組進(jìn)行疫苗免疫效果研究，并在首免前和免疫后30 d、60 d、90 d采血分離血清，使用核酸提取試劑盒提取血樣核酸，采用TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)血樣中PCV2病毒含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，PCV2亞單位疫苗免疫組仔豬血樣中PCV2病毒含量最少，免疫PCV2全病毒疫苗組病毒含量次之，對(duì)照組中PCV2病毒含量最多。PCR檢測(cè)方法靈敏度高，可對(duì)病原進(jìn)行快速特異性檢測(cè)，疫苗免疫后對(duì)病毒血癥及時(shí)檢測(cè)也至關(guān)重要。

3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)

抗體檢測(cè)是最常規(guī)也是檢驗(yàn)疫苗免疫效果的最經(jīng)典方法，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)方法是抗體檢測(cè)中最快速有效的方法，是將特異性抗原進(jìn)行包被后測(cè)定疫苗免疫后血清中的抗體效價(jià)，該方法操作方便，能夠快速進(jìn)行抗體檢測(cè)。Gu Z等[3]為研究PRV疫苗的免疫效果，使用15頭4周齡仔豬（不含 PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV），每組5頭仔豬，隨機(jī)分成3組，第1組用PRV Bartha-K61疫苗接種，第2組用滅活的PRV vZJ01ΔgE/ gI疫苗接種，第3組為對(duì)照組，用PBS接種。在接種14 d后用相同的方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫接種，并在接種7 d、14 d、21 d、28 d、35 d收集血樣，用ELISA和血清病毒中和試驗(yàn)（NT）對(duì)PRV的抗體進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，在免疫后4～5周，滅活的PRV vZJ01ΔgE/ gI疫苗免疫豬比用Bartha-K61疫苗接種的豬產(chǎn)生顯著更高的特異性免疫應(yīng)答（P＜0.05），

但抗體水平顯示PRV vZJ01ΔgE/ gI疫苗組和Bartha-K61組相似。李英等[4]對(duì)山東日照市8個(gè)養(yǎng)豬采集240份樣品通過(guò)ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PRV抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示240份樣品中有195份免疫合格，合格率達(dá)到81.25%，達(dá)到國(guó)家規(guī)定的抗體水平。ELISA檢測(cè)方法，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的試驗(yàn)設(shè)備和條件，可用于豬場(chǎng)抗體的快速檢測(cè)。

4 中和抗體檢測(cè)

血清中和測(cè)定法可評(píng)估血清樣品的中和能力，檢測(cè)血清中的抗體效價(jià)。Zhang H等[5]選用16頭5周齡雜交斷奶仔豬（CSFV呈血清陰性）對(duì)IFN-γ作為免疫佐劑的CSFV E2亞單位疫苗保護(hù)性進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)分成4組，每組4頭仔豬，A組豬（陰性對(duì)照組）肌內(nèi) 注 射2 mL PBS，B組（ 陽(yáng) 性對(duì)照組）的豬肌內(nèi)注射單劑量的商業(yè)C-株疫苗，C組和D組的豬分別肌內(nèi)注射2 mL E2和E2-IFN-γ亞單位疫苗，進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)測(cè)定。所謂中和測(cè)定，即將血清樣品在56 ℃下熱滅活30 min，連續(xù)稀釋2倍，然后在100 ℃下與100 TCID50CSFV Shimen菌株混合60 min。將血清-病毒混合物加入在96孔板中培養(yǎng)的匯合PK-15細(xì)胞中，然后在37 ℃下孵育3 d，用PBS洗滌PK-15細(xì)胞3次，并用冷的80%丙酮固定30 min，然后將固定的細(xì)胞與E2 MAb（1∶100稀釋）一起，在37 ℃下溫育 1 h。然后用PBS洗滌3次，將細(xì)胞與異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG在37 ℃溫育1 h，然后用PBS洗滌3次，在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，C-菌株、E2和E2＋I(xiàn)FN-γ基團(tuán)誘導(dǎo)CSFV產(chǎn)生的中和效價(jià)更高，但在初次免疫后28 d，這3組之間沒(méi)有觀察到顯著差異（P＞0.05），中和滴度在14 d達(dá)到峰值，C-菌株組的平均中和抗體滴度為1∶304，E2亞單位疫苗組為1∶362，E2＋I(xiàn)FN-γ亞單位疫苗組為1∶608。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中在E2和E2＋I(xiàn)FN-γ組之間沒(méi)有觀察到中和抗體滴度的顯著差異。

5 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)是用抗體對(duì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行捕獲，并以酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)的形式顯現(xiàn)出來(lái)。Oh T等[6]對(duì)4種韓國(guó)PRRSV商品化疫苗（Porcilis PRRS、UNISTRAIN PRRS、Ingelvac PRRS MLV、Fostera PRRS）免疫效果進(jìn)行研究。其選用28日齡的200頭仔豬，每40頭豬分為1組、共分5組，分別為Vac1A組免疫Porcilis PRRS、Vac1B組免疫UNISTRAIN PRRS、Vac2A 組 免疫ngelvac PRRS MLV、Vac2B組免疫Fostera PRRS和對(duì)照組注射等體積的PBS，并采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)免疫效果評(píng)估，即在外周血單核細(xì)胞（PBMC）中測(cè)定用從農(nóng)場(chǎng)分離的野外病毒刺激的PRRSV特異性干擾素 -γ分泌細(xì)胞（IFN-γ-SC）的數(shù)量。將接種于（5×105個(gè)PBMC /孔）的PBMC用MARC-145細(xì)胞裂解物（感染復(fù)數(shù)等于0.01）作為回憶抗原刺激20 h，在37 ℃，5 % CO2的條件下孵育。 使用自動(dòng)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELIPOT）測(cè)定ELISPOT讀數(shù)器對(duì)膜上的IFN-γ陽(yáng)性斑點(diǎn)進(jìn)行成像，分析和計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，與未接種組相比所有4個(gè)接種組的仔豬在PBMC中具有顯著（P＜0.05）更高數(shù)量的PRRSV-1和PRRSV-2特 異 性 IFN-γ-SC（ UnVac） 在21 d、56 d和84 d。 在56 d和 84 d時(shí)，Vac1A和Vac1B組與Vac2A和Vac2B相比豬在PBMC中具有顯著更 高（P＜ 0.05） 的 PRRSV-1特異性IFN-γ-SC 數(shù)量。在21 d、56 d和84 d時(shí)，Vac2A和Vac2B組 與Vac1A和Vac1B組相比豬在PBMC中具有顯著更高（P＜0.05）的PRRSV-2特異性IFN-γ-SC數(shù)量。最后，在84 d時(shí)Vac2B組與Vac2A組相比，豬在PBMC中具有顯著更高（P＜0.05）的PRRSV-2特異性IFN-γ-SC數(shù)量。該方法靈敏度較高，比傳統(tǒng)的ELISA方法靈敏度高很多，操作方面可進(jìn)行高通量檢測(cè)。

6 攻毒試驗(yàn)

攻毒保護(hù)試驗(yàn)是評(píng)價(jià)疫苗免疫效果最直接的方法，抽取一定數(shù)量的免疫豬只，用于疫苗對(duì)應(yīng)的強(qiáng)毒病原微生物進(jìn)行人工感染，檢測(cè)疫苗的免疫保護(hù)效果。陳果亮[7]選取34日齡斷奶仔豬50頭，隨機(jī)分5組，每組10頭，A、B、C、D組接種不同廠家豬瘟疫苗免疫，E組作為空白對(duì)照組。在A、B組疫苗免疫后第7天后進(jìn)行攻毒，肌注（1 mL）1×104TCID50石門(mén)豬瘟強(qiáng)毒，同時(shí)對(duì)疫苗空白對(duì)照E組進(jìn)行同等劑量攻毒。攻毒后每天對(duì)豬只溫度和臨床變化進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)豬只在攻毒后14 d進(jìn)行全部剖檢，進(jìn)行組織病理性和病毒核酸檢測(cè)。結(jié)果顯示，免疫豬瘟疫苗組在進(jìn)行攻毒后沒(méi)有出現(xiàn)明顯的臨床變化，豬只體溫正常，疫苗免疫空白對(duì)照組在攻毒后2 d，豬只出現(xiàn)高熱稽留，其中1頭急性發(fā)病于攻毒后第9天死亡，其他豬只食欲下降、精神沉郁，皮膚出現(xiàn)豬瘟出血點(diǎn)或出血斑癥狀，攻毒后14 d對(duì)照組豬只全部死亡，對(duì)免疫組和對(duì)照組進(jìn)行剖檢觀察，對(duì)照組出現(xiàn)典型的豬瘟病理變化，而免疫組臟器未見(jiàn)變化。其研究結(jié)果表明，豬瘟疫苗的疫苗免疫效果明顯，保護(hù)率高。

7 總結(jié)

近年來(lái)，許多病原嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展，如我國(guó)新出現(xiàn)的非洲豬瘟就給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫接種是防控傳染病的重要手段[8]，規(guī)?；酿B(yǎng)豬場(chǎng)更要做好豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病等疫苗免疫工作，定時(shí)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理做好衛(wèi)生清潔工作，堅(jiān)持預(yù)防為主的養(yǎng)殖模式。建立疫苗免疫檢測(cè)體系，避免因疫苗失效、疫苗劑量不足、藥物刺激、功能性疾病、免疫方法等不當(dāng)導(dǎo)致的免疫失敗[9]，使我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康、穩(wěn)定的發(fā)展。