陳嘉蔚，趙培靜，鄧錦波，李姣清，明飛平，張淑霞，盧悄佳，張玲華

（1.華南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院/廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白功能與調(diào)控重點實驗室，廣東 廣州 510642；2.廣州市微生物研究所，廣東 廣州 510663）

細菌通過稱為群體感應（quorum sensing，QS）的機制響應細菌群體密度變化，進而調(diào)控目的基因的表達。細菌分泌一種小分子自誘導物（Autoinducer，AI），該信號物質(zhì)可以通過自由擴散進入細胞壁和細胞膜，當其濃度隨細菌密度增加而提高到一個臨界濃度時，細菌群體就能響應信號分子表現(xiàn)出某些生物學功能，以適應環(huán)境變化，為種群爭取更大的優(yōu)勢［1-2］。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acylhomoserine lactones，AHLs）是細菌群體感應系統(tǒng)中的關(guān)鍵信號分子，它在革蘭氏陰性細菌群體感應系統(tǒng)中普遍存在，調(diào)控多種致病菌毒力因子、胞外多糖和抗生素的表達，促進生物膜形成和孢子產(chǎn)生，強化自身群體與其他細菌、真菌、植物和動物的生存競爭［3］。當AHLs濃度達到閾值，能激活致病基因的表達，誘發(fā)細菌性軟腐病、青枯病、真菌侵染、灰霉病等疾病，嚴重危害經(jīng)濟作物［4-6］。幾種土壤細菌可以通過酶降解AHLs來干擾QS，該現(xiàn)象被稱為群體淬滅［7］。大部分芽胞桿菌可以通過自誘導物失活（Autoinducer inactivation，AiiA）蛋白水解AHLs的內(nèi)酯環(huán)，從而破壞細菌的QS系統(tǒng)，減弱其產(chǎn)生的危害［8］。因此，利用AiiA蛋白降解AHLs分子來防治細菌性植物病害的研究也逐漸展開，目前AHLs的降解已被證明是控制植物細菌性感染的有效方法［9-11］。

然而，由于芽孢桿菌表達的AiiA蛋白是一種胞內(nèi)蛋白，表達水平較低，也不能分泌到胞外對環(huán)境中的AHLs分子進行降解，因此目前國內(nèi)外對提高AiiA蛋白的表達量及活性研究主要包括兩大方向：構(gòu)建外源高效分泌表達AiiA蛋白的工程菌以及將aiiA基因轉(zhuǎn)化植株，但aiiA基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達對植物生長、發(fā)育以及轉(zhuǎn)基因食品對人體的影響尚不清楚，歐陽樂軍等成功構(gòu)建了aiiA基因的植物表達載體 pCAM-aiiA，總體而言轉(zhuǎn)aiiA植物的研究相對較少［12-13］。目前，AiiA蛋白已經(jīng)在原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)中得到了表達，如大腸桿菌、蘇云金芽孢桿菌原核表達系統(tǒng)和畢赤酵母真核表達系統(tǒng)［14-16］。但大腸桿菌異源性表達目的蛋白容易形成包涵體等缺點使其研究及在工農(nóng)業(yè)上的應用受到一定限制。研究發(fā)現(xiàn)，不同表達系統(tǒng)的aiiA基因存在密碼子偏好性差異，其中芽胞桿菌aiiA基因與畢赤酵母差異較大，如需實現(xiàn)aiiA基因的高效表達必須進行密碼子突變或者進行全序列同義合成［17-18］。本研究從枯草芽孢桿菌中擴增胞苷脫氨酶（CDD）基因的啟動子P43以及aiiA基因，采用搭橋PCR的方法將P43強啟動子連接到aiiA基因上游，構(gòu)建P43-aiiA-C11重組枯草芽孢桿菌，重組菌株具有良好的降解AHLs能力，對將AiiA蛋白應用于農(nóng)作物病害防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌（E. coli）DH5α、根 癌 農(nóng) 桿 菌（Agrobacterium tumefaciens）NTL4（pZLR4）（含traG-lacZ融合基因和traR基因，羧芐青霉素抗性，慶大霉素抗性）、根癌農(nóng)桿菌 NTL4 （pTiC58ΔaccR，含traI基因）由華南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院微生物實驗室保存，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）C11（該菌株是本實驗室前期通過大量田間實驗分離篩選得到的具有良好預防青枯病致病菌作用的生防菌株）；pMD20-T載體購于大連寶生物公司，pHY300PLK枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭載體購于TaKaRa公司。

1.1.2 工具酶及其他試劑XbaⅠ、EcoRⅠ等限制性內(nèi)切酶、pfu高保真酶、Taq聚合酶購于TaKaRa公司；羧芐青霉素（Car）、慶大霉素（Gm）等抗生素購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 引物 根據(jù)NCBI上已公布的枯草芽孢桿菌P43啟動子序列（EF473728.1）以及aiiA基因序列（DQ000640.1），設計2對引物（Primer 1/2、Primer 3/4） ，引物由上海生工公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2 試驗方法

1.2.1 PCR擴增P43啟動子與aiiA基因 以本實驗室從枯草芽孢桿菌總DNA中擴增得到的P43啟動子和aiiA基因為模板，以Primer 1/2和Primer 3/4為引物分別進行PCR擴增。PCR反應體系：10× pfu buffer 2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1 μL，引物 Primer 1/2 或 Primer 3/4（10 pmol/L）各1 μL，pfu酶0.5 μL，模板1 μL，補ddH2O至20 μL。PCR反應程序：94℃預變性3 min，（94℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min）×30循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.2.2 搭橋PCR連接P43啟動子與aiiA基因PCR反應得到的啟動子P43擴增片段3’端帶有aiiA擴增片段的第1～20個堿基，aiiA基因擴增片段5’端帶有P43擴增片段的15個堿基。將PCR反應得到的P43啟動子與aiiA基因擴增產(chǎn)物純化后混合，用Primer 1和Primer 4進行PCR擴增（具體流程見圖1）。PCR反應體系：10× pfu buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.5 μL， 引 物Primer 1、Primer 4（10 pmol/L）各 2.5 μL，pfu 酶0.5 μL，P43與aiiA擴增回收產(chǎn)物各1 μL，補ddH2O至50 μL。PCR反應程序：94℃預變性3 min，（94℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸2 min）× 30循環(huán)，72℃延伸10 min。

圖1 搭橋PCR擴增P43-aiiA

1.2.3 構(gòu)建P43-aiiA-pHY300PLK重組質(zhì)粒 將PCR擴增得到的P43-aiiA片段純化回收后與pMD20-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α后進行菌落PCR與雙酶切鑒定并提取質(zhì)粒送測序，鑒定正確后利用XbaⅠ、EcoRⅠ對P43-aiiA片段和pHY300PLK載體進行雙酶切，純化回收后進行連接，并轉(zhuǎn)化DH5α進行鑒定與測序，重組質(zhì)粒命名為P43-aiiA-pHY300PLK（具體流程見圖2）。鑒定正確后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌C11。

圖2 P43-aiiA-pHY300PLK重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.4 驗證AiiA酶活性 AiiA酶活性檢測參照文獻［19］的方法并略作改進。用根瘤農(nóng)桿菌NTL4（pZLR4）作為指示菌檢測長?；淎HLs，該菌株攜帶含有traR和traG-lacZ融合基因的質(zhì)粒pZLR4，長酰基鏈AHLs可誘導traR蛋白的轉(zhuǎn)錄，激活traG-lacZ融合基因的表達，β-半乳糖苷酶的活性可用于traG轉(zhuǎn)錄的報告［20-21］。根癌農(nóng)桿菌 NTL4 （pTiC58ΔaccR）含有traI基因，其編碼traI蛋白可以大量合成AHLs分子［22］。將根癌農(nóng)桿菌NTL4（pTiC58ΔaccR）的16 h培養(yǎng)液離心，取上清過濾除菌，按2%接菌至過濾上清液，接野生型枯草芽孢桿菌C11作陰性對照，陽性對照用新鮮YEP培養(yǎng)液接待測菌，培養(yǎng)過夜后，離心取上清液作樣品。

檢測方法一：取上清液10 μL加至含X-gal的條狀YEP瓊脂培養(yǎng)基，待上清液基本被培養(yǎng)基吸收后，在樣品下方均勻點接指示菌NTL4（pZLR4），每個0.8 μL，28℃培養(yǎng)24 h后觀察并記錄試驗結(jié)果（具體操作見表2），待測樣品點樣處與最遠的藍色菌落的距離若小于陰性對照，表明該樣品具有AiiA活性。

檢測方法二：將指示菌NTL4（pZLR4）涂布至含X-gal的YEP平板，取樣品上清液10 μL加至平板上，28℃培養(yǎng)24 h后觀察試驗結(jié)果，待測樣品點樣處藍色菌落范圍若小于陰性對照，表明該樣品具有AiiA活性，范圍越小則AiiA活性越高。

表2 驗證AiiA活性流程

2 結(jié)果與分析

2.1 P43啟動子與aiiA基因的克隆

通過PCR擴增出帶酶切位點的P43啟動子與aiiA基因片段大小分別應為308 bp和776 bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段大小與預期結(jié)果相符，但P43啟動子擴增產(chǎn)物有非特異條帶（圖3），對P43啟動子與aiiA基因擴增產(chǎn)物進行切膠回收。

圖3 P43啟動子與aiiA基因擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒P43-aiiA-pHY300PLK的構(gòu)建

通過SOE PCR擴增得到的P43-aiiA片段應為1 069 bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段大小與預期結(jié)果相符（圖4）。

圖4 P43-aiiA片段擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

將P43-aiiA片段與pMD20-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α后進行菌落PCR鑒定并提取質(zhì)粒送測序，測序結(jié)果正確；對P43-aiiA片段和pHY300PLK質(zhì)粒進行雙酶切與連接，并轉(zhuǎn)化DH5α進行鑒定與測序，測序結(jié)果正確。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌C11，進行菌落PCR與雙酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，菌落PCR擴增條帶大小與雙酶切片段大小都與預期結(jié)果相符（圖5），重組菌株命名為P43-aiiA-C11。

2.3 AiiA酶活驗證

AiiA活性檢測結(jié)果見圖6A，陰性對照中指示菌NTL4（pZLR4）幾乎全部變藍，只有最下端菌落藍色較淺；3個平行試驗的指示菌至條狀培養(yǎng)基中間藍色開始變淺，至下端全部為白色菌落。由圖6B可知，平板上試驗組藍色擴散范圍（25 mm）比陰性對照（15 mm）小，而陽性對照中均為白色菌落。說明農(nóng)桿菌NTL4（pTiC58ΔaccR）培養(yǎng)液上清中含有AHLs分子，而實驗所構(gòu)建的P43-aiiA-C11菌株具有高于野生型C11菌株的淬滅酶活性，能明顯降解信號分子。

圖6 P43-aiiA-C11菌株AiiA酶活驗證

3 結(jié)論與討論

本試驗成功擴增P43啟動子和aiiA基因的聯(lián)合片段P43-aiiA，構(gòu)建含有P43啟動子和aiiA基因的穿梭載體P43-aiiA-pHY300PLK，并成功導入枯草芽孢桿菌中表達。與野生型菌株相比，構(gòu)建菌株P(guān)43-aiiA-C11表達產(chǎn)物具有顯著的降解AHLs能力，為構(gòu)建防治植物病害的基因工程菌株帶來了新方向，對減少農(nóng)作物致病因素具有重要意義。

AiiA蛋白能夠降解革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的信號分子AHLs，從而抑制致病菌的生長以及致病基因的表達，達到生物防治的效果。但天然AiiA蛋白的表達量較低，溫真等［23］用aiiA基因的啟動子代替pET-28a中的T7啟動子，經(jīng)熒光顯微鏡鏡觀察，發(fā)現(xiàn)aiiA基因的啟動子強度并不是很強，較新的研究表明aiiA啟動子中還包含負調(diào)控序列［24］。為了提高AiiA蛋白的表達量，吳懷光等［25］利用蘇云金芽孢桿菌S-層蛋白基因與殺蟲晶體蛋白基因cry3Aa啟動子與aiiA基因融合表達，得到了能高效和穩(wěn)定表達AiiA蛋白的蘇云金芽孢桿菌菌株。曾世涌等［26］利用枯草芽孢桿菌eglS基因的啟動子與信號肽序列在枯草芽孢桿菌中表達蘇云金芽孢桿菌aiiA基因，表達的AiiA蛋白對胡蘿卜歐文氏桿菌表現(xiàn)出一定的抗病性。陳珺君等［27］利用野生型多黏芽胞桿菌表達蘇云金芽胞桿菌aiiA基因，結(jié)果表明AiiA蛋白對胡蘿卜歐文氏菌具有抗病活性，但不具有抑菌活性。然而，在天然環(huán)境下，異源性表達無可避免會遇到密碼子偏好性差異的問題，影響目的基因的表達。2007年P(guān)an等［28］首次從枯草芽孢桿菌中克隆得到aiiA基因，因此本研究選用枯草芽孢桿菌C11作為表達菌株表達枯草芽孢桿菌aiiA基因，枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)具有表達量高、生長迅速、適應性強、容易培育的優(yōu)點，與大腸桿菌表達系統(tǒng)相比，利用枯草芽孢桿菌表達的重組蛋白大多具有生物活性和維持天然結(jié)構(gòu)，枯草芽孢桿菌也是目前應用較廣的微生物殺菌劑之一。

本研究通過搭橋PCR擴增枯草芽孢桿菌啟動子P43以及aiiA基因的聯(lián)合片段，連接穿梭載體pHY300PLK轉(zhuǎn)化草芽孢桿菌。P43是組成型啟動子，研究發(fā)現(xiàn)P43啟動子在枯草桿菌生長對數(shù)前期已開始表現(xiàn)活性，隨后轉(zhuǎn)錄活性迅速提高，有利于AiiA蛋白在天然環(huán)境下持續(xù)性表達［29-30］。Wan等［31］通過啟動子替換構(gòu)建pMA0911-P43-PUL，在同等條件下測定支鏈淀粉酶最高酶活可提高2倍。本研究利用指示菌NTL4（pZLR4）在AHLs存在的條件下能在含有X-gal平板上長出藍色菌落的原理，通過在條狀培養(yǎng)基上點接指示菌和在平板上涂布指示菌，均驗證P43-aiiA-C11菌株對AHLs信號分子具有明顯淬滅活性。而AiiA蛋白不含信號肽［32］，研究工作將進一步提高AiiA蛋白的分泌表達，增強其在土壤環(huán)境中降解AHLs分子的效力。