吳 雙， 朱善元， 郭長(zhǎng)明， 秦 楓， 左偉勇， 王永娟， 洪偉鳴， 王安平

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院/江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇泰州 225300)

犬細(xì)小病毒(CPV)感染是以嘔吐和腹瀉并伴有胃腸道出血等為主要病征的急性傳染性疾病，加拿大、美國(guó)和澳大利亞同年報(bào)道從患腸炎的病犬糞便中分離到CPV，該病很快在全世界范圍內(nèi)傳播。各年齡段犬均可發(fā)病，以6月齡以下幼犬發(fā)病和死亡較多[1]。作為細(xì)小病毒中最易變異的病毒[2]，1980年報(bào)道，1978—2000年從最初的CPV-2型演變出現(xiàn)了CPV-2a，與CPV-2相比潛伏期更短、腸炎癥狀更嚴(yán)重、糞便中病毒含量低；1984年報(bào)道了CPV-2b，2000年報(bào)道了CPV-2c，2010年在國(guó)內(nèi)首次被鑒定，致病性更強(qiáng)，3種抗原變異株。近10年來，世界各地出現(xiàn)了New CPV-2a、New CPV-2b和New CPV-2c優(yōu)勢(shì)抗原變異株，其中New CPV-2a/b主要在中國(guó)、韓國(guó)和日本等亞洲國(guó)家流行。New CPV-2a/b與CPV-2a/b區(qū)別在于VP2蛋白上297位氨基酸發(fā)生了突變，改變了與宿主細(xì)胞受體的親和力[3-4]。CPV-2的變異主要是通過VP2基因定向漂移產(chǎn)生新抗原變異株[5]，只是在VP2蛋白上5～8個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了變化，但卻導(dǎo)致抗原性、致病性和宿主譜發(fā)生改變[6]。CPV-2是一種無囊膜、單股負(fù)鏈的易變異DNA病毒，基因組約為5 200個(gè)核苷酸，編碼的結(jié)構(gòu)蛋白包括VP1和VP2，其中VP2 是病毒結(jié)構(gòu)蛋白，含有CPV的主要抗原決定簇，約占病毒衣殼蛋白90%的比重。VP2蛋白在決定病毒的宿主范圍、結(jié)合及進(jìn)入細(xì)胞過程中均起到了重要作用[7-8]。由于CPV-2的復(fù)制和組裝須要借助宿主細(xì)胞中的多種DNA復(fù)制酶，因此只能在分裂間期細(xì)胞中復(fù)制，所以采用同步接毒法來分離病毒[9]。本試驗(yàn)采用同步接毒法利用F81和MDCK細(xì)胞分離到1株CPV，該病毒屬于CPV-2a亞型，為了滿足后續(xù)測(cè)定重組犬干擾素活性試驗(yàn)的需要，測(cè)定了該分離株的病毒滴度。

1 材料與方法

1.1 疑似犬細(xì)小病毒病病料的采集

江蘇省泰州某寵物醫(yī)院收治了3例疑患犬細(xì)小病毒病的病犬，病犬均出現(xiàn)典型的腹瀉癥狀、嘔吐、消瘦、鼻鏡干燥等臨床癥狀，采集病犬的新鮮糞便，先按照韓國(guó)安捷公司生產(chǎn)的CPV膠體金快速診斷試紙說明書進(jìn)行檢測(cè)，后采集檢測(cè)為陽性犬的新鮮糞便，將其置于含3%胎牛血清、10%雙抗的RPMI-1640，于-80 ℃下備用。

1.2 細(xì)胞、常用試劑

F81和MDCK購自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰酶、青鏈雙抗，購自GIBCO公司；安捷快速檢測(cè)CPV抗體試劑盒、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、PrimeSTAR? HS DNA聚合酶、大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5αCompetent Cells、Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR?試劑盒、DNA marker、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒等，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 犬細(xì)小病料處理

病料反復(fù)凍融3次后擠凈棉簽，5 000 r/min×10 min離心后的上清經(jīng)0.22 μm過濾至滅菌凍存管中。在F81細(xì)胞消化傳代的同時(shí)將代接種的病料上清按照1 ∶10接種細(xì)胞培養(yǎng)液比例采用同步接毒法傳代，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，再換2% DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。若有80%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)時(shí)，收獲病毒；按照1 ∶30比例進(jìn)行傳代。如果沒有出現(xiàn)CPE則于4～5 d收取上清，細(xì)胞傳代至第3代仍無CPE，則判斷為陰性。同時(shí)，利用MDCK細(xì)胞按照上述方法進(jìn)行病毒分離。

1.4 DNA的提取、VP2基因片段測(cè)序及分析

參考GenBank發(fā)布的CPV基因，設(shè)計(jì)1對(duì)引物[CPV-VP2-U，5′-AGAGACAATCTTGCACCAAT-3′；CPV-VP2-D1755，5′-TATAATTTTCTAGGTGCTAGTTG-3′引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成]。

按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑使用說明書流程提取陽性病料中病毒基因組DNA，將DNA模板置于-80 ℃?zhèn)溆谩＿\(yùn)用高保真酶PrimeSTAR? HS DNA聚合酶擴(kuò)增VP2基因，PCR反應(yīng)條件為：98 ℃10 s；60 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)。利用Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR?試劑盒連接膠回收目的片段，轉(zhuǎn)化后挑取白色菌落，將菌落PCR方法鑒定為陽性的菌液送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序，至少送3個(gè)陽性克隆測(cè)序。應(yīng)用 Lasergene軟件對(duì)VP2基因核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，應(yīng)用MEGA5.03采用Maximum Likelihood法(最大似然法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析。

1.5 病毒滴度的測(cè)定

將培養(yǎng)的病毒液反復(fù)凍融3次后，用2% DMEM維持液做10倍比稀釋，取10-1～10-7稀釋度接種MDCK細(xì)胞。將MDCK細(xì)胞消化稀釋為2×105個(gè)/mL后鋪布于96孔細(xì)胞板，每孔加100 μL細(xì)胞懸液，再將稀釋好的病毒液接種于孔中，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度重復(fù)10孔。每個(gè)稀釋度做2個(gè)陰性對(duì)照孔，每孔加入100 μL維持液，37 ℃培養(yǎng)72 h，鏡檢，觀察細(xì)胞形態(tài)并記錄病變孔的數(shù)目，通過組織細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)計(jì)算病毒滴度，按Reed-Muench法計(jì)算結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 CPV細(xì)胞分離結(jié)果

按同步接毒法接種F81細(xì)胞，僅病料3從第2代次開始出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)，細(xì)胞發(fā)生變圓、拉網(wǎng)狀、脫落、崩解等形態(tài)變化，將分離到的病毒命名為CPV-F。細(xì)胞在接毒72 h出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(圖1-A)，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)正常(圖1-B)；其他2份病料傳至第3代仍無CPE，判斷為陰性。

采用上述的同步接毒法接種MDCK細(xì)胞后僅病料3從第3代次出現(xiàn)CPE，命名為CPV-M。從圖2可以看出，在MDCK細(xì)胞培養(yǎng)72 h時(shí)出現(xiàn)的細(xì)胞病變。

2.2 PCR擴(kuò)增及其序列分析

通過PCR方法擴(kuò)增得到的片段與預(yù)期片段大小一致，3份病料均擴(kuò)增到目的片段，1、2、3泳道依次命名為CPV1、CPV2、CPV3。從圖3可以看出，3份病料中病毒含量差異明顯。

經(jīng)切膠回收TA克隆后僅CPV3測(cè)序成功。根據(jù)VP2基因核苷酸序列的測(cè)序結(jié)果繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，CPV3位于2a分支中，基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹見圖4。

將測(cè)序獲得的CPVVP2基因及推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行分析，該分離株的426位為天冬酰胺，符合CPV-2a亞型的特征。與上述引用的21株VP2基因的同源性為99.2%～99.9%，氨基酸同源性亦為99.2%～99.9%。系統(tǒng)發(fā)生樹表明CPV3與上海分離株CPV/CN/SH1/2013(KR002792)親緣關(guān)系最近。

2.3 病毒滴度的測(cè)定結(jié)果

在加入病毒72 h時(shí)通過記錄MDCK病變孔的數(shù)目，運(yùn)用Reed-Muench法計(jì)算TCID50數(shù)值，其中CPV-M-5的TCID50數(shù)值為10-4.83/0.1 mL，CPV-M-10的TCID50數(shù)值為10-5.50/0.1 mL。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)從疑似感染犬細(xì)小病毒病的糞便中分離到1株病毒，經(jīng)2種細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)的鑒定獲得CPV3，該病毒屬于CPV-2a亞型，測(cè)定了2個(gè)代次的病毒滴度，為后續(xù)測(cè)定重組犬干擾素活性提供了基礎(chǔ)材料。

CPV由于自身所帶基因限制，其復(fù)制增殖病毒前期所需的酶均要宿主細(xì)胞提供，要求宿主細(xì)胞必須處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，故細(xì)小病毒培養(yǎng)分離多采用同步接毒方法[10]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，分離CPV常用細(xì)胞有F81和MDCK，由于F81細(xì)胞出現(xiàn)CPE更加明顯，所以成為分離CPV最常用的培養(yǎng)細(xì)胞。本試驗(yàn)中CPV感染的F81和MDCK細(xì)胞均出現(xiàn)CPE，雖然F81出現(xiàn)CPE時(shí)間更早、癥狀更明顯，但是MDCK中CPE癥狀也是很容易觀察到，這些細(xì)胞病變情況與相關(guān)報(bào)道較一致。

本試驗(yàn)中應(yīng)用膠體金試紙條和PCR檢測(cè)技術(shù)結(jié)果相一致，3份病料均檢測(cè)到含有CPV，但在細(xì)胞分離病毒的過程中，只有病料3分離到CPV。結(jié)果表明，膠體金試紙條和PCR檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于病毒分離，而分離到病毒的難度要高于檢測(cè)到病毒。本研究中擴(kuò)增的VP2基因全長(zhǎng)為1 755個(gè)核苷酸，共編碼584個(gè)氨基酸。該病毒與CPV-2的VP2基因推導(dǎo)的氨基酸相比，共有Met87Leu、Ile101Thr、Ala300Gly、Asp305Tyr、Val555Ile 5個(gè)氨基酸序列發(fā)生了突變，據(jù)此判定CPV3屬于CPV-2a亞型。分析VP2基因序列發(fā)現(xiàn)，CPV3位于遺傳進(jìn)化樹的2a分支中，且與國(guó)內(nèi)分離株的親緣關(guān)系普遍較近，該遺傳進(jìn)化樹一定程度上表明國(guó)內(nèi)分離的CPV沒有明顯的地域差異。

為了后續(xù)試驗(yàn)的需要，對(duì)分離CPV-M進(jìn)行傳代增殖并測(cè)定TCID50數(shù)值，CPV-M-5的TCID50數(shù)值略低于CPV-M-10的TCID50數(shù)值，表明毒株的毒力在傳代中逐漸增強(qiáng)。傳代導(dǎo)致毒力增強(qiáng)的原因還有待于進(jìn)一步研究闡明。