家禽羽毛降解菌WYM39的分離鑒定及其產(chǎn)酶特性

文冰潔， 李曉霞， 柯 欣， 蘭新慧， 賈良輝， 顏 華

(西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西楊凌 712100)

隨著現(xiàn)代社會家禽消費量的不斷增加，家禽加工廠的副產(chǎn)品——羽毛也在快速積累[1]。羽毛占成熟家禽活體質(zhì)量的5%～7%[2]。一般家禽羽毛會被傾倒，被填埋或焚燒，造成土壤、水和空氣的巨大污染，羽毛的積累不僅導致環(huán)境污染，也是羽毛資源的浪費[3]。羽毛的主要成分是角蛋白[4]，角蛋白富含二硫鍵[5]和疏水側(cè)鏈，使羽毛堅韌而耐化學腐蝕[6]。傳統(tǒng)的降解羽毛的方法，如堿水解法和蒸汽高溫高壓水解法，不僅會破壞產(chǎn)物中的氨基酸[7]，同時消耗大量能量、造成成本高等問題[8]。由于環(huán)保意識的增強，生物降解羽毛的方法越來越受到人們的關注[9]。角蛋白不能被常見的蛋白水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等降解，但很容易被微生物產(chǎn)生的角蛋白酶水解[10]。細菌、放線菌、真菌等都可以產(chǎn)生角蛋白酶[11]，以絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶為主，在較寬的溫度范圍和pH值范圍內(nèi)具有活性[12]。角蛋白酶作為特殊的酶，不僅可以用于飼料和肥料產(chǎn)業(yè)，還可擴展到洗滌劑產(chǎn)業(yè)、皮革工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)[4]。此外，角蛋白酶能滅活朊病毒，在此方面有應用潛力[13]。為了豐富角蛋白降解的菌株資源，提供生長快速、產(chǎn)酶量高、具應用潛力的菌株，同時拓展角蛋白酶的獲得來源，為發(fā)現(xiàn)更高效的角蛋白酶奠定基礎，筆者采用以雞羽毛為唯一碳氮源的分離培養(yǎng)基，對從1處雞圈采集的土樣，經(jīng)初篩和復篩，選擇降解效果最為突出的1株菌(編號為WYM39)，并對其進行16S rDNA分析及產(chǎn)酶條件和酶學特性的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 2016年8月采集湖南省桑植竹林養(yǎng)雞場羽毛堆積處地表5 cm的土壤，室內(nèi)風干后儲存于4 ℃。試驗于2016年9月至2017年12月在西北農(nóng)林科技大學生命科學學院放線菌分子生物學實驗室進行。

1.1.2 培養(yǎng)基 羽毛粉培養(yǎng)基：羽毛粉10.0 g，K2HPO41.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.4 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水 1 000 mL，121 ℃滅菌25 min；牛奶培養(yǎng)基：脫脂奶粉5.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL，115 ℃滅菌20 min；液體羽毛培養(yǎng)基：整根的羽毛10.0 g，K2HPO41.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.4 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌25 min。

1.2 羽毛降解放線菌的分離

1.2.1 土壤樣品的處理 稱取(1.0±0.001) g土樣置于 80 ℃ 干熱消毒箱中處理2 h后，將其加入處理液[酵母膏 0.6 g，十二烷基硫酸鈉(SDS)0.005 g，生理鹽水10 mL，121 ℃ 滅菌25 min]，30 ℃，150 r/min培養(yǎng)30 min。

1.2.2 使用羽毛粉培養(yǎng)基進行分離及牛奶培養(yǎng)基初篩 將“1.2.1”節(jié)中的處理液稀釋為10-2、10-3、10-4、10-54個梯度，取稀釋后的處理液100 μL分別涂布于羽毛粉培養(yǎng)基平板上，每個梯度設3個重復。將樣品于28 ℃倒置培養(yǎng)，每天觀察1次，挑取單菌落于牛奶培養(yǎng)基上，通過觀察有無水解圈進行初篩。

1.2.3 使用液體羽毛培養(yǎng)基進行復篩 將初篩的菌株進行傳代、純化，純化后接種于具有整根羽毛的液體羽毛培養(yǎng)基，將具有顯著降解作用的菌株保藏于50%甘油中。綜合其生長情況，挑選1株生長快、降解效果好的菌株(編號為WYM39)進行后續(xù)試驗。

1.3 羽毛降解菌WYM39的鑒定

1.3.1 菌株形態(tài)特征掃描電鏡觀察 挑取菌株WYM39的孢子在羽毛粉培養(yǎng)基上劃線接種，在劃線處斜插入經(jīng)過無菌處理的蓋玻片，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)數(shù)天后用掃描電鏡觀察。

1.3.2 菌株16S rDNA測定 使用Kirby Mix法[14]提取菌株WYM39的總DNA，使用通用引物F27/R1522(引物F27序列5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，引物R1522序列5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，簡稱PCR)擴增，回收PCR產(chǎn)物連接pMD-18T載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，選擇陽性克隆，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。將菌株WYM39的16S rDNA序列在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)網(wǎng)站中進行局部對比基本檢索工具(basic local alignment search tool，簡稱BLAST)分析，通過Mega 5.0，以Neibour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 菌株生理生化特征 菌株生長溫度、最適pH值、NaCl耐受性、唯一碳源、唯一氮源、明膠液化、脲酶、淀粉水解、牛奶凝固與胨化、產(chǎn)H2S和纖維素分解試驗參照文獻[15]。

1.4 羽毛降解菌WYM39產(chǎn)酶條件研究

1.4.1 酶活的測定 本試驗使用酪蛋白[casein(Sigma)]作為底物進行菌株WYM39粗酶液的酶活測定，參照文獻[16]進行酶活測定和酪氨酸標準曲線測定。定義40 ℃下1 min每釋放1 μg酪氨酸，升高1個酶活單位。

1.4.2 培養(yǎng)時間對菌株WYM39產(chǎn)酶的影響 將菌株WYM39接種于液體羽毛培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min條件下分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h，以菌液上清為粗酶液測定酶活。

1.4.3 培養(yǎng)溫度對菌株WYM39產(chǎn)酶的影響 菌株WYM39接種于液體羽毛培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度分別為20、25、30、35、40 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)96 h，取粗酶液測定酶活。

1.4.4 初始pH值對菌株WYM39產(chǎn)酶的影響 將菌株WYM39接種于初始pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的液體羽毛培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)96 h，取粗酶液測定酶活。

1.4.5 初始NaCl濃度對菌株WYM39產(chǎn)酶的影響 將菌株WYM39接種于初始pH值為7.0，初始NaCl濃度分別為0、10、20、30、40、50、60、70 mg/mL的液體羽毛培養(yǎng)基中，于 30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)96 h，取粗酶液測定酶活。

1.5 對菌株WYM39酶學特性的初步研究

1.5.1 反應溫度對酶活的影響 粗酶液與底物反應時，分別設置溫度為30、40、50、60、70 ℃，測定并記錄不同反應溫度下的酶活。

1.5.2 反應pH值對酶活的影響 使用幾種不同pH值的緩沖液配制pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的反應底物，與粗酶液混合后于最適溫度下反應，測定并記錄不同pH值對酶活的影響[16]。

1.5.3 WYM39粗酶液的溫度穩(wěn)定性 將粗酶液于30、40、50、60、70 ℃條件下處理30 min后，在最適溫度及最適pH值條件下測定酶活。

1.5.4 金屬離子對酶活的影響 在1 mL粗酶液中分別加入5、50、500、5 000 μmol的K+、Na+、Ca2+、Mg2+，混合后在 30 ℃ 放置30 min后測定酶活。

1.5.5 化學試劑對酶活的影響 在1 mL粗酶液中分別加入1 mmol苯甲基磺酰氟(PMSF)、1 mmol乙二胺四乙酸(EDTA)、10 μLβ-巰基乙醇、10 μg十二烷基硫酸鈉(SDS)、10 μL 異丙醇、10 μg二硫蘇糖醇(DTT)、10 μL二甲基亞砜(DMSO)，混合后在30 ℃放置30 min后測定蛋白酶活。

1.5.6 測定底物特異性 分別以可溶底物偶氮酪蛋白、酪蛋白；不可溶底物天青角蛋白、羽毛粉測定菌株WYM39粗酶液的酶活，不同底物的酶活測量方法參照文獻[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選及菌株WYM39角蛋白降解效果觀察

將采自雞圈地表的土樣處理后稀釋濃度為10-4倍涂布于羽毛粉培養(yǎng)基平板上，挑取能在其上生長的單菌落接種在牛奶培養(yǎng)基平板上，將能夠在牛奶培養(yǎng)基上產(chǎn)生明顯降解圈的菌株傳代、純化，接種于整根羽毛配制的液體羽毛培養(yǎng)基中，選擇1株具有生長快、降解效果好等特點的菌株進行后續(xù)研究，將其編號為WYM39。菌株WYM39在接種量為1%、30 ℃、150 r/min培養(yǎng)4 d時，能將100 mL液體羽毛培養(yǎng)基中的1 g完整羽毛完全降解(圖1)。

2.2 菌株WYM39的形態(tài)特征

菌株WYM39在羽毛粉培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)96 h，掃描電鏡觀察結(jié)果如圖2所示，基絲無隔不斷裂，直徑0.3～0.6 μm；孢子短桿狀，大小0.7～1.2 μm。在牛奶培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，能觀察到明顯降解圈，菌落呈圓形，有白色孢子氣絲，基絲黃褐色。

2.3 菌株WYM39的16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

提取菌株WYM39基因組DNA后，使用通用引物F27/R1522擴增得到菌株WYM39的16S rDNA，進行序列測定。菌株WYM39的16S rDNA序列大小為1 517 bp，將其在NCBI網(wǎng)站中進行BLAST分析，通過Mega 5.0，以Neibour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。該菌株與中間型鏈霉菌(Streptomycesintermedius)的相似度最高，為99%。

2.4 菌株WYM39的生理生化特征

菌株WYM39不僅能利用葡萄糖等多種碳源，還能利用亮氨酸、甲硫氨酸等氮源，但不能利用天冬氨酸、谷氨酸。菌株WYM39可在含有150 mg/mL NaCl的培養(yǎng)基中生長，且能分解明膠、淀粉，還能使牛奶胨化，但不能降解纖維素，也不能產(chǎn)生脲酶和H2S。其具體生理生化特征見表1。

2.5 菌株WYM39的產(chǎn)酶條件研究

2.5.1 培養(yǎng)時間對菌株WYM39產(chǎn)酶的影響 如圖4所示，在培養(yǎng)時間為96 h時，酶活性出現(xiàn)峰值。發(fā)酵前期是菌體生長的時間，后期由于營養(yǎng)物質(zhì)(羽毛)被耗盡，酶活性降低，因此96 h是研究菌株WYM39產(chǎn)酶條件合適的培養(yǎng)時長。

2.5.2 培養(yǎng)溫度對菌株WYM39產(chǎn)酶的影響 如圖5所示，在培養(yǎng)溫度為30 ℃時酶活性最高，培養(yǎng)溫度低于25 ℃或高于35 ℃時，酶活性很低，說明30 ℃是研究菌株WYM39產(chǎn)酶條件合適的培養(yǎng)溫度。

表1 菌株WYM39的生理生化特征

注：“-”表示陰性；“+”表示陽性。

2.5.3 初始pH值對菌株WYM39產(chǎn)酶的影響 如圖6所示，初始pH值在5.5～7.0時，酶活性在較高水平，在初始pH值為7.0時，酶活出現(xiàn)峰值，因此pH值為7.0是菌株WYM39產(chǎn)酶條件研究的合適初始pH值。

2.5.4 初始NaCl濃度對菌株WYM39產(chǎn)酶的影響 如圖7所示，初始NaCl濃度為0時酶活性最高，隨著初始NaCl濃度的升高，酶活逐漸降低，當NaCl濃度高于30 mg/mL后酶活降至極低水平，結(jié)合生理生化試驗結(jié)果可知，菌株WYM39可在含有0～150 mg/mL NaCl的培養(yǎng)基中生長，但初始NaCl濃度為0是菌株WYM39產(chǎn)酶條件研究的合適初始NaCl濃度。

2.6 菌株WYM39粗酶液酶學特性研究

2.6.1 菌株WYM39粗酶液最佳反應溫度和溫度穩(wěn)定性測定 如圖8所示，該酶最適反應溫度為60 ℃；溫度穩(wěn)定性測定試驗結(jié)果如圖9所示，該酶在60 ℃下30 min后仍保存89%的酶活性。

2.6.2 菌株WYM39粗酶液最佳反應pH值 如圖10所示，粗酶液在反應pH值為8.0時酶活性最高，在pH值為7.5～9.0范圍內(nèi)能保持93%的酶活性。

2.6.3 化學試劑和金屬離子對菌株WYM39粗酶液酶活的影響 如表2所示，和粗酶液的酶活性相比，PMSF、EDTA對粗酶液的酶活性具有抑制作用，而DTT、β-巰基乙醇、異丙醇、SDS、DMSO能夠提高該酶的催化活性。

金屬離子對菌株WYM39粗酶液影響試驗結(jié)果如圖11所示，K+、Na+、Ca2+、Mg2+在低濃度(5 μmol/mL)時對粗酶液的酶活性幾乎沒有影響，但在高濃度(5000μmol/mL)時對酶活有抑制作用，其中Ca2+的抑制作用最強。

表2 化學試劑對粗酶液酶活力的影響

2.6.4 菌株WYM39粗酶液的底物特異性 如表3所示，粗酶液可以降解可溶的偶氮酪蛋白、酪蛋白，也可降解不可溶的羽毛和天青角蛋白。

表3 不同底物對粗酶液酶活的影響

3 討論與結(jié)論

在接種量為1%、30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)時，菌株WYM39能在4 d將100 mL以整根羽毛為唯一碳氮源的培養(yǎng)基中的1 g羽毛完全降解，對雞羽毛有較強的降解能力。結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化特征、16S rDNA基因序列分析、基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的進化樹，初步確定菌株WYM39為鏈霉菌屬(Streptomyces)的1個菌株。當反應體系中的Ca2+達到50 μmol/mL或PMSF為1 mmol/mL時，粗酶液的活性被抑制，表明該酶屬于絲氨酸蛋白酶。菌株WYM39的粗酶液在反應溫度為60 ℃時酶活最高，并在經(jīng)60 ℃處理30 min后仍能保存89%的酶活，有在高溫下應用的潛力。在底物特異性試驗的補充試驗中發(fā)現(xiàn)，反應體系添加10 μL/mL的β-巰基乙醇后，降解羽毛粉和天青角蛋白時酶活分別從4.97和 2.57 U/mL 提升到12.6和7.2 U/mL，分別提高了1.5和1.8倍，說明還原劑的存在對角蛋白降解有重要作用。此外，本試驗僅采用以羽毛為唯一碳氮源的液體培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方單一，有通過優(yōu)化培養(yǎng)基配方提高產(chǎn)酶能力的潛力。