陳 蒙，張 雪，張 宇，楊銘慧，劉海峰

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

山葡萄 (Vitisamurensis) 為葡萄科葡萄屬。原產(chǎn)地主要在我國東北部，分布在吉林、遼寧和內(nèi)蒙古地區(qū)[1-2]，是栽培范圍最廣泛的果樹種類之一，在果樹生產(chǎn)中具有重要地位。山葡萄抗病性較強，對黑痘病、白粉病和炭疽病有較強的抵抗能力[3]。山葡萄味酸、微澀，富含漿汁，是制造葡萄酒的最佳原料，所釀制的葡萄酒的顏色深紅，風(fēng)味品質(zhì)很好，口感醇正，深受人們喜愛。山葡萄果皮顏色的深淺，主要取決于花色苷的含量，因此對花色苷研究十分重要。

花色苷(Anthocyanin)為一種水溶性色素，以糖苷形式存在于植物體內(nèi)，是類黃酮化合物，是植物花、果實以及控制葉片顏色變化的重要組成成分。種皮花色素含量的多少決定種皮顏色的深淺，種皮色澤的差別與花色素的含量呈正相關(guān)[4]。在釀造葡萄酒時葡萄中的多種花色苷與其他物質(zhì)相互作用，產(chǎn)生新的花色苷，而且在后續(xù)釀造過程中繼續(xù)產(chǎn)生反應(yīng)，生成許多復(fù)雜的花色苷色素衍生物[5]?；ㄉ展δ芎芏?，主要使植物器官產(chǎn)生不同顏色，另外花色苷對于種子傳播、授粉、抵抗病原物侵染、防紫外線損傷等諸多方面都表現(xiàn)出了明顯作用[6-7]?；ㄉ辗植荚谥参锏母鱾€組織中，使植物呈現(xiàn)出色彩斑斕的顏色[8-10]。但由于花色苷穩(wěn)定性影響因子多、降解機制復(fù)雜，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，全面開展花色苷的降解機制和如何提升花色苷穩(wěn)定性的研究極其重要。有學(xué)者研究表明，花色苷在生物合成中，受多種基因約束，其中編碼蛋白酶的是結(jié)構(gòu)基因，調(diào)節(jié)蛋白酶活性的是調(diào)節(jié)基因，二者進行協(xié)同調(diào)節(jié)，共同調(diào)控這類色素物質(zhì)的積累過程。

山葡萄花色苷的生物合成是一個十分復(fù)雜的過程，分為2種途徑，一種是苯丙烷類代謝途徑，另一種是類黃酮途徑。在花色苷合成過程中，3 分子的丙二酰-CoA 和 1 分子的對香豆酰-CoA 結(jié)合形成第 1 個具有 C15 架的黃酮類化合物[11]。在 1960 年，Neish 驗證了 PAL 可以促使花青素合成[12]。PAL 基因的表達方式多樣，其活性的干擾因素較多，具有一定的組織特異性。苯丙氨酸解氨酶在有顏色的葡萄品種表達很強，在白色葡萄中表達很少或者不表達。很多植物 PAL 的集中部位在根部，老熟葉片不表達[13]。PAL 的活性較高，大多數(shù)存在植物的木質(zhì)化組織中，但非木質(zhì)化組織中沒有 PAL 的活性[14-16]。PAL 基因是一個多基因家族，PAL 蛋白第1次在麥子(Hordeumvulgare) 中被發(fā)現(xiàn)[17]，隨后被證實廣泛存在于植物、真菌、酵母和藻類中。植物 PAL 基因家族成員對各類激素以及逆境威脅的影響存在差異，在植物體各個組織和各個發(fā)育期的表達也有所差別。

目前對山葡萄花色苷調(diào)控相關(guān)基因進行分析和研究的報道較少，本試驗從山葡萄8個著色期時期進行研究，探索控制合成花色苷的限速酶PAL基因在山葡萄漿果時期到成熟期的基因表達量。試驗結(jié)果為今后研究山葡萄花色苷積累與相關(guān)基因變化規(guī)律及調(diào)控作用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為深入研究控制山葡萄果皮成熟過程的重要基因建立基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

采摘山葡萄雙紅幼嫩完整無病蟲害的葉片，隨后置于-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑材料

RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScriptTM購自Promega公司。實時熒光定量，選用SYBRGreenⅠ試劑盒，購自QIAGEN公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA樣品提取和檢測 采用CTAB法[18]對山葡萄葉片基因組 DNA 提取后，經(jīng) Eppendorf 核酸檢測儀檢測，測定DNA 的質(zhì)量。

1.3.2 PAL基因引物的設(shè)計與合成 在 NCBI 網(wǎng)站中，下載 GenBank 中與山葡萄近緣植物的 PAL 基因的氨基酸序列，使用多序列比對方法找到保守區(qū)域，利用Primer 6.0設(shè)計特異引物。引物序列如下：PAL-s：5′-TGCTTGATACAGGTTCTTGAATGCT-3′；PAL-a：5′-CCTAGCAGATTGGGAGAGGAGCACC-3′，在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.3 PCR擴增目的基因片段 利用 PAL基因引物進行 PCR 擴增來獲得目的基因片段。擴增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。使用 PAL 引物進行菌液 PCR 檢測，將陽性克隆的菌樣郵寄到生工生物有限公司進行測序。

1.3.4 PAL基因序列分析 將測序后的序列使用 NCBI 網(wǎng)站進行 Blast 比對，以驗證測序結(jié)果的正確性。并使用生物信息學(xué)軟件進行序列分析，用到的軟件如表1所示。

1.3.5 實時熒光定量PCR分析 以延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院山葡萄雙紅群體中挑選的果實飽滿、無病蟲害的果粒為材料。分8個時期取樣，分別為花后28 d、轉(zhuǎn)色前、轉(zhuǎn)色10%、轉(zhuǎn)色30%、轉(zhuǎn)色50%、轉(zhuǎn)色80%、轉(zhuǎn)色100%和完熟期。取其果皮，液氮中速凍，置于-80 ℃保存。采用改良CTAB法提取山葡萄8個不同著色時期的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。使用Primer 5.0軟件，根據(jù)已經(jīng)克隆到的PAL基因全長序列，設(shè)計VamPAL引物。內(nèi)參基因選用ACTIN(Accession No.AB073011)。設(shè)計的引物序列如下：上游引物VamPALa：5′-TGCTTGATACAGGTTCTTGAATGCT-3′；下游引物VamPALs：5′-AAGACCAGCGATGTAG GAGA-3′。從上述8個時期的cDNA 模板中任選其一，依次稀釋1，5，25，125，625倍5個梯度來制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，反應(yīng)設(shè)3個重復(fù)，反應(yīng)體系：2×SuperReal Premix Plus 10 μL、10 μmol/L 的正反向引物各0.6 μL、cDNA模板1 μL、50×POX Reference Dye 0.4 μL、RNase-free ddH2O補至總體積為20 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火32 s，60 ℃延伸32 s，循環(huán)40次。擴增完畢后，對PCR產(chǎn)物進行熔解曲線分析。利用MxPro軟件完成數(shù)據(jù)處理。

表1 生物信息學(xué)分析網(wǎng)上軟件Tab.1 The online software for bioinformatics analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 山葡萄總DNA

如圖1所示，使用核酸檢測儀和凝膠成像儀檢測DNA濃度和質(zhì)量，DNA 的 OD260/280值為 1.75，表明 DNA 純度較高，可進行后續(xù)試驗。

圖1 DNA電泳圖Fig.1 DNA electrophoresis map

2.2 VamPAL 基因全長的克隆與生物信息學(xué)分析

以提取 DNA 為模板，PAL-a、PAL-s為引物進行 PCR 擴增，得到1條1 763 bp 的序列(圖2)。經(jīng)Blast 比對后發(fā)現(xiàn)，它與歐亞種葡萄(GenBank登錄號：JN858963)同源性達到100%，認(rèn)定該序列為山葡萄PAL基因的核苷酸序列。提交PAL的核苷酸序列，GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)登錄號是MH045991。運用 DNAStar 軟件分析，該 DNA 序列具有完整的開放閱讀框 1 671 bp，3′-UTR 為 9 bp，5′-UTR 為85 bp，推斷它能編碼 556 個氨基酸。命名為VamPAL。

圖2 VamPAL基因PCR電泳圖譜Fig.2 VamPAL gene PCR electrophoretogram

2.3 基因編碼蛋白質(zhì)理化性狀分析

運用 ProParam 程序，對山葡萄VamPAL基因所編碼蛋白的理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果顯示，該蛋白是由 556 個氨基酸構(gòu)成，分子量 (MV) 為 61.07 ku，等電點為 5.76。在構(gòu)成山葡萄 VamPAL 蛋白的 20 種氨基酸中亮氨酸 (Leu) 的量最多，為 11.5%；色氨酸 (Trp) 的量最少，為 0.9%，無吡咯賴氨酸(Pyl)和硒半胱氨酸(Sec)。正電荷殘基 (Arg+Lys) 個數(shù)是 52，負(fù)電荷殘基 (Asp+Glu) 個數(shù)是 67，不穩(wěn)定性系數(shù)是 30.42，脂溶系數(shù)是 92.07，說明山葡萄 VamPAL 蛋白為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.4 VamPAL 蛋白保守區(qū)預(yù)測

對VamPAL基因的蛋白保守區(qū)域進行預(yù)測，結(jié)果表明，山葡萄VamPAL含有苯丙氨酸解氨酶超級家族結(jié)構(gòu)域，屬于 PAL 家族蛋白。其特征序列為 GTVTASGDLVPLSYIAG，位于該蛋白的 39-55 位氨基酸(圖3)。

圖3 VamPAL基因編碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Functional domain analysis of VamPAL encoded protein

2.5 VamPAL 蛋白的親水性分析

使用 ProtScale 軟件對 VamPAL 蛋白質(zhì)親水性進行分析(圖4)，其中縱坐標(biāo)表示疏水性系數(shù)，橫坐標(biāo)表示序列所處位點。根據(jù)氨基酸數(shù)值越小親水性越強，數(shù)值越大親水性越弱的規(guī)律可以看到，疏水性最大值在 123 的位置上，數(shù)值是 2.389；最小值在 447 的位置上，數(shù)值是-2.856，總的親水性平均值是-0.178，因此，VamPAL是親水性蛋白。

圖4 VamPAL 蛋白序列的親水性分析Fig.4 Hydrophilic analysis of VamPAL protein sequence

2.6 VamPAL 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析

運用 TM-pred 在線分析VamPAL基因的氨基酸序列可知，PAL 蛋白在 41-59，105-123，347-363，540-556 區(qū)域可能形成 4 個分別以 49，113，355，548 為中心的由內(nèi)到外的跨膜螺旋，在 39-56，105-124，347-363 區(qū)域分別以47，113，355 為中心形成 3 個由外到內(nèi)跨膜螺旋(圖5)。

2.7 VamPAL 蛋白的信號肽預(yù)測及二級結(jié)構(gòu)分析

使用 SignalP 4.1 Server 軟件預(yù)測山葡萄VamPAL基因的氨基酸序列是否具有信號肽，分析表明，山葡萄VamPAL基因編碼的蛋白無信號肽。

運用網(wǎng)上資源 HNN 推測VamPAL基因的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明(圖6)，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)是由 44.78%的無規(guī)卷曲、47.30%的 α-螺旋和7.91%的 β-折疊構(gòu)成。

圖5 VamPAL蛋白序列的跨膜分析Fig.5 Transmembrane analysis of VamPAL protein sequence

A.α-螺旋；E.無規(guī)卷曲；R.β-折疊。A.Alpha helix；E.Random coil；R.Extended strand.

2.8 細(xì)胞定位分析

使用 TargetP 1.1 軟件對 VamPAL 蛋白序列進行細(xì)胞定位分析，分析結(jié)果顯示，該蛋白在線粒體中的可能性為 0.256，在分泌途徑中存在的可能性為 0.094?？煽考墑e為 4(表2)。

2.9 山葡萄 VamPAL編碼蛋白質(zhì)的同源性及進化分析

使用 NCBI 的工具 BlastP 對獲得的山葡萄 PAL 基因的氨基酸序列進行同源性比對，比對結(jié)果表明，山葡萄 PAL 基因同歐亞種葡萄(GenBank登錄號：ABM67591)、荔枝(GenBank登錄號：ACR15762)等 PAL類基因的同源性相近，相似性分別為 100%，99%。運用多重序列比對軟件，將山葡萄VamPAL及其他 9 種植物 PAL基因編碼的氨基酸序列比對分析，結(jié)果如圖 7(下劃線為保守域)所示。

表2 VamPAL蛋白的TargetP 1.1定位分析結(jié)果Tab.2 VmPAL protein TargetP 1.1 positioning analysis results

圖7 山葡萄VamPAL與其他植物的PAL氨基酸多序列比對Fig.7 Alignment of the predicted amino acid sequences of VamPAL in Vitis amurensis and those of several other plants

2.10 山葡萄 VamPAL 基因及其他物種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生進化樹

為了對山葡萄VamPAL和其他物種的 PAL 基因進行深入的研究，在多重比對的基礎(chǔ)上，使用分子生物學(xué)軟件 MEGA 5.0，對山葡萄VamPAL基因及其他物種 PAL 基因的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生進化樹。分析結(jié)果如圖 8所示，山葡萄VamPAL基因同歐亞種葡萄同源性最近，同水稻、甘蔗等植物的同源性較低。

2.11 山葡萄苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的表達分析

2.11.1 采用改良CTAB法提取山葡萄 采用改良CTAB法[19]提取山葡萄8個不同著色時期的總RNA，如圖9所示。依據(jù)核酸檢測儀和凝膠成像儀檢測RNA濃度和質(zhì)量，保證RNA完整、無雜質(zhì)污染，進行反轉(zhuǎn)錄。

圖8 不同物種PAL類基因構(gòu)建的分子進化樹Fig.8 The molecular evolutionary tree of different PAL genes

圖9 八個時期RNA電泳Fig.9 Agarose gel electrophoresis of 8 stage total RNA

2.11.2 實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 標(biāo)準(zhǔn)的熔解曲線是呈單一峰的，若有多個峰產(chǎn)生，說明有非特異性擴增產(chǎn)生。此次試驗中，通過圖10觀察到，ACTIN、PAL對引物的溶解曲線呈單一峰，擴增特異性較高，獲得的結(jié)果具有較高的可靠性。圖11為ACTIN、PAL這2個基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。橫坐標(biāo)是初始模板量的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。從圖11可以看出，PAL基因的相關(guān)系數(shù)為0.999，接近1，說明定量結(jié)果可靠，所用引物及反應(yīng)條件符合熒光定量PCR擴增的要求。

圖10 ACTIN、PAL對引物的溶解曲線Fig.10 ACTIN, PAL on the primer dissociation curve

圖11 ACTIN、PAL基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.11 ACTIN, PAL genes of the standard curve

2.11.3VamPAL基因在葡萄果皮不同著色時期的表達水平分析 以內(nèi)參基因ACTIN，選任一時期為對照，進行實時熒光定量PCR，探究VamPAL基因在葡萄生長發(fā)育過程中，果皮在8個時期的表達規(guī)律，結(jié)果如圖12所示，縱坐標(biāo)代表相對表達量，橫坐標(biāo)代表轉(zhuǎn)色時期。VamPAL基因從轉(zhuǎn)色前第Ⅱ個時期(花后28 d)到完熟期表達量逐次遞減，轉(zhuǎn)色50%和轉(zhuǎn)色100%幾乎不表達，VamPAL基因的表達量呈遞減趨勢。

圖12 VamPAL基因在8個時期的表達規(guī)律Fig.12 VamPAL gene expression pattern in eight periods

3 結(jié)論與討論

PAL 是催化苯丙烷類代謝的第1步反應(yīng)酶，也是苯丙烷途徑的關(guān)鍵酶，在植物發(fā)育過程、次生代謝以及果實著色等過程中起重要作用。PAL 基因主要存在于高等植物，微生物和某些藻類中，在動物體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)。隨著研究工作的進行，研究人員陸續(xù)在大量植物中證實了PAL基因的存在，并且發(fā)現(xiàn)PAL 基因在大多數(shù)植物中是以多基因家族存在的。PAL 基因家族成員定位的組織具有差異性，其特異性受外源因子的誘導(dǎo)，調(diào)控的代謝途徑各有差異[20-22]。本試驗借鑒前人方法與經(jīng)驗[23]，從山葡萄里克隆得到其 PAL 基因 DNA 全長序列，且命名為VamPAL。用生物信息學(xué)軟件進行多序列比對分析，預(yù)測其蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，它由無規(guī)卷曲、α-螺旋、β-折疊構(gòu)成，此結(jié)果與前人得出的葡萄、大豆等 PAL 蛋白二級結(jié)構(gòu)結(jié)論相同，表明VamPAL和其他植物已分離 PAL基因有極高同源性，尤其是歐亞種葡萄，并具有相同蛋白質(zhì)保守活性位點。

通過 PCR 技術(shù)，從山葡萄果皮里成功克隆到苯丙氨酸解氨酶基因全長序列。VamPAL基因全長 1 763 bp，屬于苯丙氨酸解氨酶超基因家族，含有多個跨膜結(jié)構(gòu)域，該基因編碼的蛋白不具有信號肽，整體表現(xiàn)為親水性，是穩(wěn)定的親水蛋白，其和歐亞種葡萄(GenBank登錄號：ABM67591)、PAL類基因的同源性相近，相似性為 100%。

NCBI數(shù)據(jù)庫登陸的葡萄PAL信息共有8個，其中，cDNA序列5個，DNA序列3個。根據(jù)葡萄品種來源，PAL序列來源及氨基酸序列相似性，選取PAL1(品種：Vitisvinifera；PAL序列來源：genomic DNA；核苷酸登錄號：FM213198；氨基酸登錄號：CAR82483)、PAL2(品種：Vitisvinifera；PAL序列來源：cDNA；核苷酸登錄號：GU585850；氨基酸登錄號：ADP07927)、PAL3(品種：Vitisvinifera；PAL序列來源：cDNA；核苷酸登錄號：EF192469；氨基酸登錄號：ABM67591)、PAL4(品種：Vitisvinifera；PAL序列來源：genomic DNA；核苷酸登錄號：JN858963；氨基酸登錄號：AEX32790)、PAL5(品種：Vitisvinifera；PAL序列來源：genomic DNA；核苷酸登錄號：JN858957；氨基酸登錄號：AEX32784)、PAL6(品種：Vitisvinifera；PAL序列來源：cDNA；核苷酸登錄號：X75967；氨基酸登錄號：CAA53581)、PAL7(品種：Vitisamurensis；PAL序列來源：cDNA；核苷酸登錄號：GQ443745；氨基酸登錄號：ACV60529)、PAL8(品種：Vitisamurensis；PAL序列來源：cDNA；核苷酸登錄號：GQ443744；氨基酸登錄號：ACV60528)以及梨PAL基因(GenBank登錄號：FJ478149、FJ478150)、小麥PAL基因(GenBank登錄號AY005474)、甜蕎PAL基因(GenBank登錄號：GU363529)、油松PAL基因(GenBank登錄號：AF013485)和VamPAL進行分析,經(jīng)Blast軟件比對，結(jié)果顯示PAL3、PAL4、PAL5、PAL6的同源性為99%，與梨PAL基因(GenBank登錄號：FJ478149、FJ478150)同源性也比較高，可能是參與調(diào)控木質(zhì)素合成等相關(guān)代謝的PAL酶[24]。PAL1、PAL2、PAL7與小麥PAL基因(GenBank登錄號AY005474)親緣關(guān)系較近，推測PAL基因在誘發(fā)水楊酸的形成上起到重要作用[25]。VamPAL與甜蕎PAL基因(GenBank登錄號：GU363529)親緣關(guān)系較近，可能是參與調(diào)控黃酮類化合物合成的PAL酶[26]。而PAL8與催化形成反式肉桂酸的油松PAL基因(GenBank登錄號：AF013485)親緣關(guān)系較近[27]。PAL基因的表達調(diào)控受內(nèi)部和外部調(diào)節(jié)[28]，內(nèi)部發(fā)育調(diào)節(jié)PAL酶的活性，在山葡萄生長發(fā)育前期呈一定規(guī)律變化。PAL基因在轉(zhuǎn)色50%和轉(zhuǎn)色100% 這2個時期幾乎不表達，這可能受到某種抑制PAL酶活性因子在該時期表達量的影響，這一結(jié)論與李莉等[29]的研究觀點基本一致，即PAL基因在苯丙氨酸代謝途徑中果皮轉(zhuǎn)色50%和轉(zhuǎn)色100%這2個時期的表達量相對較少，可能受植物體內(nèi)某種內(nèi)源性抑制物質(zhì)的影響，這種物質(zhì)可能是某些氨基酸、反式肉桂酸等。李會宣等[30]對鴨梨PAL基因家族基因表達水平研究表明，PAL還參與了果期木質(zhì)素的合成，且PAL基因在果實的發(fā)育過程中的表達存在明顯差異。王敬文等[31]通過生物激素誘導(dǎo)甘薯塊根，得出植物激素對PAL酶活性有刺激作用。

苯丙氨酸代謝途徑是植物最重要的次生代謝途徑之一，越來越多的研究者關(guān)注到苯丙氨酸代謝途徑關(guān)鍵酶的研究。PAL基因的表達調(diào)控受很多因素調(diào)節(jié)，本次研究PAL基因在山葡萄果皮8個時期的表達規(guī)律，分析PAL基因在轉(zhuǎn)色50%和轉(zhuǎn)色100%幾乎不表達的原因，可為探索山葡萄果皮轉(zhuǎn)色階段影響花色苷組成的關(guān)鍵酶的表達規(guī)律奠定基礎(chǔ)。