桑筱筱，操燕明，楊艾玲，王敬，杜松云

（武漢華夏理工學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430223）

淀粉酶是產(chǎn)量最大、用途最為廣泛的一種酶，在動(dòng)、植物以及微生物中廣泛存在[1]。由于工業(yè)的發(fā)展，社會(huì)對(duì)該酶的需求日漸增多[2-4]。淀粉酶能催化α-1,4糖苷鍵水解，并將淀粉分解為多種重要的產(chǎn)物，如單糖分子、糊精等，在生活中的許多方面都有重要的用途，是工業(yè)生產(chǎn)中重要的一類酶[5-7]。能獲得淀粉酶的途徑有很多，可以從動(dòng)物、植物、微生物中獲取，工業(yè)生產(chǎn)中微生物是產(chǎn)淀粉酶的重要來(lái)源，其應(yīng)用十分廣泛，以其高效的特點(diǎn)著稱，幾乎已經(jīng)取代了其他水解淀粉的方法?，F(xiàn)代工業(yè)利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)淀粉酶已經(jīng)處在酶制劑行業(yè)的首位[7-10]。紫外誘變是進(jìn)行人工選育高產(chǎn)菌株最常用的方法，其方法操作簡(jiǎn)便，成本較低，易操作。誘變育種的目的在于選育出具有優(yōu)良性狀的菌株，能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求，并將其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)之中。紫外誘變育種具有隨機(jī)性和不確定性，因此選育出的菌株所具有的性狀具有多樣性。在工業(yè)生產(chǎn)中要求菌株的遺傳穩(wěn)定性好，相比于自然選育，紫外誘變是一種較優(yōu)的選擇，選育出來(lái)的高產(chǎn)菌株能進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本[11]。本研究的意義在于通過(guò)誘變篩選出一株高產(chǎn)淀粉酶的菌株，為該酶的工業(yè)應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。同時(shí)通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化提高產(chǎn)酶活力，篩選出一株高產(chǎn)、高效的菌株，可能會(huì)從時(shí)間、成本和人力、物力上給工業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大的進(jìn)步。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

從武漢華夏理工學(xué)院土樣中篩選的枯草芽孢桿菌菌株。

1.1.2 主要試劑及儀器

蛋白胨、可溶性淀粉、牛肉膏、瓊脂、NaCl等試劑，購(gòu)自天津市博迪化工有限公司；碘液、糊精、磷酸氫二鈉、檸檬酸等，購(gòu)自武漢欣申試化工科技有限公司。超凈工作臺(tái)（蘇州吳凈空調(diào)凈化有限公司）；臺(tái)式離心機(jī)（SIGMA）；恒溫培養(yǎng)箱（SHELLAB）；恒溫?fù)u床[伊孚森生物技術(shù)（中國(guó)）有限公司]；紫外分光光度儀（上海光學(xué)儀器廠）。

1.1.3 培養(yǎng)基

淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、可溶性淀粉20 g/L、NaCl 5 g/L、牛肉膏5 g/L、瓊脂2 g/L，自然pH。淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L、NaCl 10 g/L、蛋白胨5 g/L、自然 pH。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化

從武漢華夏理工學(xué)院一食堂附近取土壤樣品，把土樣放入燒杯加水稀釋，將土壤樣品稀釋成10-3、10-4、10-5的濃度梯度，分別涂布到淀粉培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)，在27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。根據(jù)枯草芽孢桿菌菌落特點(diǎn)，挑選出符合條件的單個(gè)菌落。將單個(gè)菌落保存到斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2 d后，接種到淀粉培養(yǎng)基上，待菌落長(zhǎng)出后用碘液染色進(jìn)行染色，記錄菌落直徑和透明圈大小，計(jì)算D/d值。

1.2.2 菌種鑒定

產(chǎn)酶菌株的鑒定參照文獻(xiàn)[12]，從菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色、芽孢染色生理生化鑒別方面對(duì)未知菌種進(jìn)行初步鑒別。

1.2.3 紫外誘變提高酶活力

本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)比微生物學(xué)中麥?zhǔn)媳葷峁軐⒕鷳乙合♂屩?04個(gè)/mL左右，采用20 W、254 nm、30 cm處紫外燈照射平板，每個(gè)平板處理的時(shí)間分別為0、2、4、6、8 min和10 min，處理完后，用保鮮膜封口后然后用報(bào)紙包好放置在27 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2 d，待長(zhǎng)出單個(gè)菌落后，計(jì)數(shù)單菌落數(shù)，代入公式計(jì)算致死率；通過(guò)碘液染色處理，分別測(cè)量單菌落的淀粉水解透明圈直徑以及菌落直徑，通過(guò)水解透明圈直徑和菌落直徑的比值（D/d值），選取比值最大的單菌落，接種到斜面培養(yǎng)基上保存。

1.2.4 優(yōu)化菌株搖瓶發(fā)酵條件

按單因素實(shí)驗(yàn)研究培養(yǎng)基pH、接種量等因素對(duì)菌株產(chǎn)淀粉酶的影響，每種變量3個(gè)重復(fù)。取平均酶活力值．在最優(yōu)化各單因素條件下用正交實(shí)驗(yàn)選擇適宜的液體發(fā)酵培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)選取接種量、淀粉含量、蛋白胨含量三因素四水平實(shí)驗(yàn)，為減少任務(wù)量，經(jīng)分析查閱資料得到了如下四組處理結(jié)果如表1：

表1 正交實(shí)驗(yàn)表

保持實(shí)驗(yàn)的其他條件不變，按正交實(shí)驗(yàn)表中方式處理發(fā)酵液，每瓶100mL裝至250mL錐形瓶中，編號(hào)為1.1、1.2、1.3、1.4，在27℃恒溫箱中搖瓶培養(yǎng)48h。最后用分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液吸光值。

1.2.5 淀粉酶的初步提純及酶活性的測(cè)定

（1）淀粉酶的初步提純

為進(jìn)一步驗(yàn)證上述正交實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行粗酶的提取，收集上述中編號(hào)為1.1、1.2、1.3、1.4四個(gè)錐形瓶中所得發(fā)酵液，將其加入離心管中以3000r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，離心10min后，去除菌體沉淀，收集上清液。在上清液中緩慢加入冰凍乙醇，用玻璃棒輕輕攪拌，加入冰凍乙醇直到終濃度為70%，邊攪拌邊觀察底部有無(wú)沉淀析出，于4℃冰箱中鹽析，使上清液中蛋白質(zhì)沉淀，放置過(guò)夜，第二天將錐形瓶取出，將溶液放入離心管中以5000r/min轉(zhuǎn)速離心20min，收集沉淀，得到粗酶。

（2） 酶活性的測(cè)定

將上述得到的初步提純的淀粉酶進(jìn)行酶活性的測(cè)定，在1-6號(hào)試管中分別加入0%、0.2%、0.5%、1%、1.5%和2.0%的可溶性淀粉稀釋液，再向試管中分別各加入1mL緩沖液和1mL蒸餾水，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。將其中編號(hào)為1.1′1.2′1.3′1.4′的各管中均加入2.0%的可溶性淀粉，加入1mL緩沖液和1mL正交實(shí)驗(yàn)中各種處理結(jié)果后所得粗酶液，進(jìn)行酶活力測(cè)定。40℃水浴保溫30min，然后加入0.5mol/L乙酸10mL，混勻吸取反應(yīng)液。之后向反應(yīng)液中加10 mL碘液，測(cè)吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的菌落特征

該菌落形狀呈圓形，顏色為不透明乳白色，邊緣較齊整，表面光滑，易挑取，如圖1所示。

圖1 菌落特征

實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)該菌進(jìn)行革蘭氏染色，用光學(xué)顯微鏡觀察，在油鏡下發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌被染成紫色，符合革蘭氏陽(yáng)性菌的特征，因此，初步判斷篩選得到的菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，如圖2所示。將篩選得到的菌株芽孢染色后，在油鏡下觀察得到該菌體呈紅色，芽孢呈藍(lán)綠色，如圖3所示，可以初步判斷篩選得到的降解淀粉酶的菌為枯草芽孢桿菌。

圖2 菌株的革蘭氏染色圖

圖3 菌株的芽孢染色圖

2.2 紫外誘變結(jié)果

2.2.1 紫外誘變處理

在20 W、254 nm、30 cm處紫外燈下照射平板，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中菌落數(shù)逐漸遞減，經(jīng)紫外照射處理后所得的菌落記錄如圖4所示。

圖4 紫外誘變處理結(jié)果

2.2.2 計(jì)算致死率及制作致死曲線

通過(guò)紫外誘變處理，將不同處理時(shí)間的菌株涂布平板放置在黑暗條件下培養(yǎng)，以未誘變菌株培養(yǎng)為對(duì)照，分別計(jì)算致死率，結(jié)果如表2所示，致死曲線如圖5所示。由致死曲線可以看出紫外線照射對(duì)芽孢桿菌的作用效果明顯，誘變時(shí)間為6 min時(shí)，致死率為65.10%，當(dāng)誘變時(shí)間為8 min時(shí)，致死率變化基本保持不變?cè)?2.40%，為保證較高的篩選概率，選擇誘變時(shí)間為8 min時(shí)候的紫外照射劑量。

表2 致死率計(jì)算結(jié)果

圖5 紫外誘變致死曲線

2.2.3 紫外誘變單菌落D/d值

選取紫外照射為8 min時(shí)的菌落，通過(guò)碘淀粉顯色處理，得到單菌落的透明圈直徑和菌落直徑及比值，結(jié)果見表3。由表3數(shù)據(jù)可以得到，通過(guò)誘變處理后，有的菌株產(chǎn)酶活力有所提高，有的降低，6號(hào)菌株的D/d值最大，因此挑選6號(hào)菌將其保存到斜面培養(yǎng)基上供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

表3 紫外誘變單菌落D/d值

2.2.4 紫外誘變突變菌株與原始菌株的對(duì)比

在相同的接種量和相同的培養(yǎng)基中，菌株培養(yǎng)48h后的突變株與野生菌株透明圈如圖6所示。在平板培養(yǎng)基上可以看出，菌落顏色均為乳白色，邊緣齊整，表面光滑，菌落大體形狀均為圓形。突變菌株與野生菌株較不同的是前者的菌落顏色稍淺于后者，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，邊緣稍有突起，出現(xiàn)透明水解圈所花時(shí)間長(zhǎng)。但出現(xiàn)的水解圈大小突變菌株明顯大于野生菌株。

在斜面培養(yǎng)基上可以看出，突變株菌株松散，生長(zhǎng)周期緩慢，而野生菌株菌落結(jié)實(shí)，生長(zhǎng)周期較快。突變菌株與野生菌株D/d值見表4，通過(guò)碘淀粉顯色處理，突變菌株的D/d值明顯高于野生菌株的D/d值，因此，突變菌株的水解淀粉的能力較強(qiáng)。

圖6 突變菌株與野生菌株

表4 突變菌株與野生菌株D/d值

2.3 搖瓶培養(yǎng)結(jié)果

2.3.1 pH值和裝液量對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

根據(jù)所測(cè)吸光值顯示，當(dāng)pH為5，裝液量為30%時(shí)，所測(cè)吸光值為0.276最大，由于細(xì)菌懸液的濃度與混濁度成正比，表明在該條件下酶活性最強(qiáng)，由此確定實(shí)驗(yàn)室搖瓶培養(yǎng)的最佳條件：pH為7，裝液量為40%，結(jié)果見表5。

表5 pH值和裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.3.2 碳源種類對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

由表6可知，當(dāng)碳源為葡萄糖時(shí)，其吸光值為1.375最大，表明在該條件下菌株活力最強(qiáng)。

表6 碳源種類對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表7正交實(shí)驗(yàn)所測(cè)吸光值可得，編號(hào)為1.1的所測(cè)吸光值最大，表明在該條件下酶活性最強(qiáng)，由此確定實(shí)驗(yàn)室搖瓶培養(yǎng)最佳結(jié)果為編號(hào)1.1處理。

表7 正交實(shí)驗(yàn)所測(cè)吸光值

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及酶活性測(cè)定結(jié)果

通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)量得到表8數(shù)據(jù)：

表8 酶活性測(cè)定

由表8前6組數(shù)據(jù)繪制酶活性曲線，如圖7所示。

圖7 淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線

正交實(shí)驗(yàn)酶活力的測(cè)定結(jié)果見表9。

表9 正交實(shí)驗(yàn)酶活力測(cè)定

由表9數(shù)據(jù)可得，1.1號(hào)試管的酶活力最強(qiáng)，得到最佳配方為接種量3%、淀粉含量5 g/L、蛋白胨含量5 g/L。

2.5 誘變菌株與野生菌株酶活力的對(duì)比

野生菌株所測(cè)吸光值A(chǔ)660為1.220，經(jīng)計(jì)算可得其酶活力為8.28 mg/mL·h，誘變菌株酶活力為10.24 mg/mL·h，結(jié)果可知經(jīng)紫外誘變和培養(yǎng)基配方的優(yōu)化，酶活力提高了1.96 mg/mL·h，產(chǎn)酶活性比出發(fā)菌株高出23.7%。

3 討論

目前對(duì)淀粉酶篩選有許多方法，最常用的方法有通過(guò)碘液染色法，在淀粉培養(yǎng)基上通過(guò)透明圈的大小和菌落直徑，確定D/d值，從中篩選出水解淀粉的菌株。但碘液染色法應(yīng)用于淀粉酶生產(chǎn)菌的篩選具有一定的局限，根據(jù)淀粉水解圈的大小來(lái)判斷菌株產(chǎn)酶活力的高低，有時(shí)也不一定完全對(duì)應(yīng)。因此，此方法只能用在初篩產(chǎn)淀粉菌株的篩選中。酶活力的大小的測(cè)定不能簡(jiǎn)單通過(guò)透明水解圈的大小來(lái)進(jìn)行判斷，應(yīng)通過(guò)更為準(zhǔn)確的方法獲得。原因有可能是培養(yǎng)平板得透明圈是固體狀態(tài)，而酶活則是在液體狀態(tài)下測(cè)定，因此，產(chǎn)酶菌株在固態(tài)和液態(tài)兩種狀態(tài)下反應(yīng)結(jié)果會(huì)有所不同。

在土壤中存在不同的產(chǎn)淀粉酶菌株，但產(chǎn)酶活力較低，因此，眾多科研工作者在提高產(chǎn)酶活力方面做了許多研究。一般采用傳統(tǒng)的誘變方法來(lái)提高酶活，比如加化學(xué)誘變劑或物理誘變等方法。產(chǎn)淀粉酶菌株多數(shù)將酶分泌到細(xì)胞外，但也有一些是分泌到細(xì)胞內(nèi)，對(duì)于胞外酶一般采用化學(xué)、物理或酶降解法去除細(xì)胞壁，釋放出細(xì)胞內(nèi)酶，進(jìn)而提高酶活力。本試驗(yàn)中篩選得到的淀粉酶其酶活性僅提高了23.7%，幅度還不夠大，因此，有待于通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行改造以提高酶活力。