李佛生, 胡舒昶, 謝 鑫, 李一璠, 汪 杭, 馮 蘭, 楊 鑫

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 四川 成都 610065)

紅原地區(qū)的牦牛是四川省阿壩藏族羌族自治州紅原地區(qū)的標(biāo)志性物種,其對(duì)高原地區(qū)高寒 、低氧等惡劣自然條件具有良好的適應(yīng)能力,其養(yǎng)殖完全依賴(lài)紅原天然草場(chǎng),其乳、肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高,在高原地區(qū)具有不可替代的生態(tài)與經(jīng)濟(jì)地位[1]。腹瀉問(wèn)題是牦牛犢不能正常發(fā)育甚至死亡的重要原因。牦牛腹瀉的感染性因素主要有細(xì)菌感染、病毒感染、寄生蟲(chóng)感染和缺乏微量元素。目前對(duì)于常見(jiàn)畜牧產(chǎn)品腹瀉問(wèn)題的研究基本都涉及細(xì)菌感染因素,如郭建超[2]、夏晨陽(yáng)[3]等探討了豬、羊腹瀉的細(xì)菌感染因素,但有關(guān)牦牛腹瀉疾病的研究多見(jiàn)病毒感染因素,少見(jiàn)對(duì)細(xì)菌感染因素研究。本實(shí)驗(yàn)有助于補(bǔ)充牦牛腹瀉在細(xì)菌感染方面的研究。

本檢測(cè)從紅原地區(qū)腹瀉犢牛采集腹瀉糞樣,分離、鑒定細(xì)菌,采用藥敏紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn),得到細(xì)菌耐藥譜,從而為紅原地區(qū)牦牛腹瀉問(wèn)題的抗生素解決方案提供了建議和參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本次試驗(yàn)所用菌株均由小組成員于2017年在四川省阿壩藏族羌族自治州中部紅原縣紅原地區(qū)16頭牦牛犢腹瀉糞樣中分離得到,本次腹瀉樣本共計(jì)16份,其中1份為血樣糞便。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

1.2.1 微生物培養(yǎng)基

PBS磷酸緩沖鹽溶液、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基(EMB)、甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基(MSA)、三糖鐵培養(yǎng)基(CN)、麥康凱培養(yǎng)基(MC)，瓊脂購(gòu)自國(guó)產(chǎn)生物試劑公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

PrimerSTAR Max DNA Polymerase、DNA Maker和PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，引物合成自成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 藥敏紙片

9種抗生素藥敏紙片(紅霉素(E)、慶大霉素(CN)、四環(huán)素(TE)、萬(wàn)古霉素(VA)、環(huán)丙沙星(CIP)、復(fù)方新諾明(SXT)、氯霉素(C)、氨曲南(ATM)、氟苯尼考(FFC))購(gòu)自英國(guó)Thermofisher SCIENTIFIC生物科技公司。

1.2.4 儀器設(shè)備

PCR儀(Bio-rad T100)、生化培養(yǎng)箱LRH-250A型、離心機(jī)(eppendorf 5424)、生物安全柜BHC-1300A2型、全自動(dòng)立式高壓滅菌器(ZEALWAY GR85DA)、冰箱BCD-301型、搖床。

1.3 菌株的分離、純化與鑒定

1.3.1 菌株的分離純化

采樣后將糞樣暫時(shí)置于冰盒中保存,并立即帶回實(shí)驗(yàn)室,按照糞樣與PBS磷酸緩沖鹽溶液比例為1∶4處理糞樣,混勻后放入離心機(jī)以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min,并取上清液備用；配置BHI液體培養(yǎng)基,在10 mL的EP管中加入5 mL BHI液體培養(yǎng)基和1 mL糞樣上清液,放入搖床中在37 ℃下?lián)u晃過(guò)夜；之后采用平板劃線法將細(xì)菌分別接種至伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)、甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基(MSA)、三糖鐵培養(yǎng)基(CN)、麥康凱(MC)培養(yǎng)基上,在37 ℃恒溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)；取出過(guò)夜培養(yǎng)的培養(yǎng)皿,挑取培養(yǎng)基上的單菌落，并接種至裝有5 mL BHI培養(yǎng)基的10 mL EP管中,在37 ℃的搖床中振蕩過(guò)夜；取出EP管得分離純化的菌株。

1.3.2 菌落的形態(tài)學(xué)鑒定

通過(guò)長(zhǎng)出菌落的形態(tài),包括大小、形狀、邊緣、光澤、質(zhì)地、顏色和透明程度等進(jìn)行粗略鑒定[4]。

1.3.3 16S rRNA基因序列分析

將分離純化好的菌株37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后,分別挑取菌落,采用16S rRNA細(xì)菌鑒定的通用引物1492R: 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′,27F: 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到目的片段約為1500 bp。PCR 擴(kuò)增體系(25 μL)： PrimerSTAR Max DNA Polymerase 12.5 μL,引物F/R各1.0 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸5 s,35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序[5-7]。

1.4 藥敏試驗(yàn)

1.4.1 菌株復(fù)蘇

從-20 ℃冰箱中取出冷凍保存的菌株,在常溫下靜置;配置LB液體培養(yǎng)基,加入到10 mL 滅菌后的EP管中,每支EP管中加入5～6 mL配置好的LB液體培養(yǎng)基;再加入復(fù)蘇后的菌液20 μL；將EP管捆綁好放入搖床中,在37 ℃下以180 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩過(guò)夜。

1.4.2 耐藥性檢測(cè)

采用藥敏紙片法測(cè)定64株菌株對(duì)9種抗生素的耐藥情況[8-11]。在培養(yǎng)皿內(nèi)放置完藥敏紙片后將培養(yǎng)皿倒置,放入37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后,通過(guò)測(cè)量抑菌圈直徑對(duì)菌株的耐藥性進(jìn)行記錄和比較,并根據(jù)CLSI M100-S20標(biāo)準(zhǔn)[12],得到不同菌株對(duì)不同抗生素的耐藥情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅原地區(qū)牦牛腹瀉樣品細(xì)菌的分離、鑒定結(jié)果

用EMB培養(yǎng)基篩選19株菌株,用MSA培養(yǎng)基篩選出16株菌株,用CN培養(yǎng)基篩選出9株菌株,用麥康凱培養(yǎng)基篩選出20株菌株。對(duì)所得菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列分析,最終篩選鑒別出64株菌株,其中包含沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、成團(tuán)泛菌和阪崎腸桿菌(見(jiàn)表1)。

表1 紅原地區(qū)牦牛腹瀉樣品細(xì)菌的分離、鑒定結(jié)果

表1(續(xù))

注：編號(hào)中的數(shù)字代表糞樣編號(hào)；編號(hào)中的第1個(gè)和第2個(gè)英文字母代表篩選出菌種所用的培養(yǎng)基英文縮寫(xiě),EMB培養(yǎng)基縮寫(xiě)為E,MSA培養(yǎng)基縮寫(xiě)為MS、CN培養(yǎng)基記為CN、麥康凱培養(yǎng)基記為MC；編號(hào)中的第3個(gè)字母表示挑取菌落的顏色,R表示紅色,W表示白色,B表示黑色,Y表示黃色。

2.2 耐藥結(jié)果

2.2.1 細(xì)菌耐藥率

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖1和圖 2)統(tǒng)計(jì),得細(xì)菌耐藥率見(jiàn)表2—表5。表中耐藥率和敏感率數(shù)值后括號(hào)內(nèi)/后的數(shù)字為樣品數(shù)，/前的數(shù)字為耐藥樣品或敏感樣品數(shù)。

圖1 大腸桿菌(9EB)的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖2 沙門(mén)氏菌(9MS)的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

具體情況如下：大腸桿菌對(duì)各藥物耐藥率R有：R(VA)(93.33%)>R(E)(86.67%)>R(C)(53.33%)>R(TE)(20.00%)>R(SXT/FFC)(13.33 %)，但對(duì)CN、CIP、ATM耐藥率為0,對(duì)CN、CIP、ATM的敏感率為100%。

沙門(mén)氏菌對(duì)各藥物的耐藥率有：R(E/VA)(100.00%)>R(C)(91.89%)>R(FFC)(8.11%)>R(SXT)(2.70%)，但對(duì)CN、TE、ATM耐藥率為0，對(duì)各種藥物的敏感率S有：S(CN/CIP/ATM)(100.00%)>S(SXT)(94.59%)>S(TE)(62.16%)>S(FFC)(40.54%)>S(C)(5.41%)。

坂崎腸桿菌對(duì)各藥物耐藥率有：R(E)(100.00%) >R(VA)(75.00%)>R(TE/C)(50.00%)>R(CIP/SXT)(25.00 %)，但對(duì)CN、ATM、FFC的耐藥率為0,對(duì)CN、ATM的敏感率為100.00%。

糞腸球菌對(duì)E/VA/C藥物的耐藥性為100.00%；CN/CIP/SXT/ATM敏感率為100.00 %，對(duì)FFC為50.00%。成團(tuán)泛菌、芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌對(duì)E/VA均耐藥,并且成團(tuán)泛菌、芽孢桿菌對(duì)C也耐藥；成團(tuán)泛菌、芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌對(duì)CN、CIP、SXT、ATM都敏感,此外,成團(tuán)泛菌和枯草芽孢桿菌還對(duì)FFC敏感,芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌還對(duì)TE敏感。

表2 大腸桿菌菌株對(duì)抗生素的耐藥情況

表3 坂崎腸桿菌菌株對(duì)抗生素的耐藥情況

表4 糞腸球菌菌株對(duì)抗生素的耐藥情況

表5 沙門(mén)氏菌菌株對(duì)抗生素的耐藥情況

2.2.2 多重耐藥譜

由圖3可知,紅原地區(qū)牦牛腹瀉樣細(xì)菌對(duì)E、VA和C耐藥,對(duì)FFC和TE的耐藥性差異很大,但對(duì)CN、CIP、ATM和SXT敏感。然而,值得注意的是,紅原地區(qū)牦牛腹瀉樣中大腸桿菌和沙門(mén)氏菌均產(chǎn)生1種以上抗生素的多重耐藥性,且大多數(shù)存在3種以上抗生素的多重耐藥情況,分別占53.33 %和91.89 %(見(jiàn)表6)。

圖3 菌株對(duì)不同抗生素的柱形耐藥譜

抗生素種數(shù)大腸桿菌耐藥菌株數(shù)占菌株數(shù)百分比/%沙門(mén)氏菌耐藥菌株數(shù)占菌株數(shù)百分比/%0種00001種213.33002種533.3338.113種及以上853.333491.89

3 討論

本次測(cè)檢從紅原地區(qū)牦牛腹瀉糞樣中分離了得到了7種共64株菌株,其中主要包括了大腸桿菌(23.44 %)和沙門(mén)氏菌(57.81 %)。而周雪雁等人從健康牦牛糞樣中分離得到糞腸球菌[13],劉明春等人從犢牛腹瀉糞樣中分離得到大腸桿菌[14]。相較于之前的研究,本實(shí)驗(yàn)從罹患腹瀉牦牛的腹瀉糞樣中分離得到更加全面的致病菌種,具有較大的參考價(jià)值。

本次檢測(cè)使用了藥敏紙片法，檢測(cè)了64株紅原地區(qū)牦牛腹瀉糞樣細(xì)菌菌株對(duì)9種抗生素的耐藥性,完善了紅原地區(qū)牦牛腹瀉致病菌的耐藥譜。通過(guò)耐藥率和多重耐藥情況可以看出,試驗(yàn)菌種的耐藥譜范圍有限,普遍對(duì)特殊的幾種抗生素(E和VA)產(chǎn)生極強(qiáng)的耐藥性,卻對(duì)其他數(shù)種抗生素(CN、CIP、SXT、ATM)表現(xiàn)出高度敏感。相比之下,喻華英等人的研究缺少了四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、氨曲南、氯霉素、氟苯尼考的藥敏試驗(yàn),但增加了頭孢唑啉、阿莫西林、諾氟沙星、痢特靈的藥敏試驗(yàn)[15-16]；劉明春等人的研究缺少了氨曲南、氯霉素、氟苯尼考的藥敏試驗(yàn),但增加了妥布霉素、丁胺卡那、頭孢他啶、頭孢哌酮、利福平、氟哌酸、呋喃妥因、卡那霉素、氨芐西林的藥敏試驗(yàn)[13],可與本次試驗(yàn)互為補(bǔ)充。與喻華英等人的藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比,本試驗(yàn)中大腸桿菌對(duì)CIP、CN極為敏感,對(duì)E高度耐藥,與其試驗(yàn)結(jié)果基本一致,但敏感和耐藥程度都相對(duì)更高；沙門(mén)氏菌對(duì)CIP、CN、SXT都極為敏感,敏感程度相對(duì)更高,而對(duì)E具有極強(qiáng)的耐藥性,這與喻華英等人的試驗(yàn)結(jié)果不相一致。

本試驗(yàn)結(jié)果中,大多數(shù)菌種對(duì)不同抗生素的耐藥性幾乎呈現(xiàn)出較為極端的情況(耐藥或敏感程度接近100 %),并且不同菌種的耐藥情況有很大重疊。這可能與紅原當(dāng)?shù)亻L(zhǎng)期使用少數(shù)幾種抗生素防治牦牛腹瀉疾病,從而導(dǎo)致致病菌對(duì)這幾種抗生素(E、VA、C)產(chǎn)生了較為單一并且極強(qiáng)的耐藥性,而對(duì)其他抗生素高度敏感有關(guān)。此外,紅原地區(qū)地處高原、較為封閉的特殊地理環(huán)境,也可能是紅原地區(qū)牦牛腹瀉糞樣中細(xì)菌具有如此獨(dú)特的耐藥情況的重要原因。

根據(jù)本次試驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè),對(duì)于紅原地區(qū)牦牛腹瀉疾病,使用多樣化的抗生素,能夠有效控制紅原地區(qū)牦牛的腹瀉病情。雖然對(duì)于引起紅原地區(qū)牦牛腹瀉的致病菌,僅僅依靠試驗(yàn)所使用的抗生素中的一種或兩種,就能有效抑制致病菌的增殖,但是由于抗生素的單一使用,極易使致病菌產(chǎn)生在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生新的耐藥性,并不適用于長(zhǎng)期控制紅原地區(qū)牦牛的腹瀉疾病。就抗生素防治而言,嘗試尋找新的抗生素,減少同種抗生素的重復(fù)使用,同時(shí)利用現(xiàn)有抗生素和新抗生素進(jìn)行防治,是較為合理解決方案。除此之外,嘗試運(yùn)用生態(tài)學(xué)方法防治紅原地區(qū)牦牛腹瀉的發(fā)生可能是更加有利于生態(tài)保護(hù)、更加持久的解決方案。