邱福祥 謝懿涵 阮威威 林國(guó)榮*

（莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建莆田 351100）

銀杏是我國(guó)獨(dú)有樹種，資源總量占全世界的90%，銀杏葉產(chǎn)量占世界的70%。銀杏樹被賦予“神奇的醫(yī)療之樹”美稱，其作為藥用己有六百多年的歷史。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者與科研機(jī)構(gòu)對(duì)銀杏葉的活性成分及其分離純化技術(shù)、藥理實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究工作。銀杏葉中含有的黃酮類化合物種類超過(guò)40種，具有極強(qiáng)的清除自由基和抗氧化能力，故而廣泛用于預(yù)防和治療心腦血管疾病。銀杏葉提取物在治療和預(yù)防疾病方面具有顯著的功效，其應(yīng)用之廣涉及醫(yī)藥、生物農(nóng)藥、獸藥、食品、化妝品等。

黃酮類化合物廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成份。眾多研究顯示，黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，包括抗氧化、抗突變、抗衰老、抗腫瘤、抗菌、調(diào)節(jié)血管滲透等作用，其中最為重要的是黃酮類化合物的抗氧化活性，主要表現(xiàn)在減少自由基的產(chǎn)生和清除自由基兩方面。本試驗(yàn)通過(guò)乙醇浸提法提取銀杏葉黃酮，著重考察大孔樹脂分離銀杏葉黃酮的工藝。通過(guò)靜態(tài)實(shí)驗(yàn)篩選出適宜富集介質(zhì)，并動(dòng)態(tài)考察其適宜上樣流速、上樣濃度、洗脫流速、洗脫劑濃度和洗脫量；通過(guò)化學(xué)方法檢測(cè)銀杏葉黃酮對(duì)超氧陰離子、羥自由基的清除作用及小鼠常壓耐缺氧試驗(yàn)，初步了解銀杏葉黃酮的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

干燥銀杏葉，購(gòu)于莆田紫金藥店；動(dòng)物，清潔級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體重（20±1.8）g，由福建醫(yī)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。

1.2 主要試劑與儀器

乙醇、AlCl3、Tris、鹽酸、硫酸亞鐵等均為分析純；盧丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所。

HZ816大孔吸附樹脂，華東理工大學(xué)華震科技有限公司；D101、HZ816、HPD450、AB-8大孔吸附樹脂，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；聚丙烯酰胺樹脂。

BHZ9146A電熱恒溫干燥器；BS224S電子天平，Sartorius公司；Spectrun752型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵；EYELA N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EYELA公司；DBS-100自動(dòng)分部收集器，上海滬西分析儀器廠；THZ-82恒溫振蕩器，江蘇天由有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮含量測(cè)定方法

黃酮吸光度測(cè)定：取1 mL樣品液于試管中，依序加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%AlCl3溶液和2 mL水，混合均勻后靜置10 min，然后于420 nm比色測(cè)定，參比對(duì)照時(shí)，AlCl3改為水，當(dāng)測(cè)定結(jié)果不在分光光度計(jì)適合范圍內(nèi)的，則對(duì)樣品液進(jìn)行適當(dāng)濃縮或稀釋至測(cè)定吸光度在0.4～0.9之間。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，用體積濃度50%的乙醇溶解，并用50 mL容量瓶定容，搖勻，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為0.20 mg/mL。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL、8.0 mL于10 mL的容量瓶中定容，搖勻配成不同質(zhì)量濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.933x-0.004 8，R2=0.999 1。

1.3.2 銀杏葉總黃酮的提取

將銀杏葉置于烘箱干燥，精確稱取一定量，置于燒杯中，并按固液比1 g∶18 mL加入體積濃度65%乙醇，放入HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋中70℃浸提3 h，進(jìn)行銀杏葉總黃酮提取，提取液經(jīng)過(guò)濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到一定體積，備用。

1.4 銀杏葉黃酮的分離純化

1.4.1 大孔樹脂預(yù)處理

將各種型號(hào)吸附樹脂經(jīng)過(guò)一定處理后再用乙醇浸泡24 h，并用蒸餾水洗至無(wú)醇味，備用。

1.4.2 富集介質(zhì)篩選

靜態(tài)吸附容量的測(cè)定：量取已處理好的D101、HZ816、HPD450、AB-8大孔吸附樹脂、聚丙烯酰胺樹脂各5.0 mL，分別置于100 mL具塞三角燒瓶中，各加入20.0 mL銀杏葉黃酮溶液，蓋緊瓶塞，置于恒溫振蕩器中恒溫振蕩，另取一個(gè)具塞三角燒瓶加入20.0 mL銀杏葉黃酮溶液作為對(duì)照組一并放入恒溫振蕩器，振蕩9 h充分吸附后,取吸附余液測(cè)定銀杏葉黃酮含量，按式（1）計(jì)算吸附量，按式

（2）計(jì)算吸附率。

將上述各瓶中混合液進(jìn)行過(guò)濾，去除吸附余液，再將其置于錐形瓶中，加入體積濃度65%乙醇30.0 mL，封口置振蕩器中振蕩2 h，檢測(cè)各樹脂解析液銀杏葉黃酮含量，按式（3）計(jì)算解吸率。

式中：C0——樣液質(zhì)量濃度，mg/mL；

C——吸附后樣液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——樣液體積，mL；

Vs——樹脂體積，mL；

C1——解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

V1——洗脫劑體積，mL。

1.4.3 樹脂HPD450對(duì)銀杏葉黃酮的富集

1.4.3.1 動(dòng)態(tài)吸附

量取15mL處理好的HPD450大孔吸附樹脂，濕法裝柱。基本條件為分別上樣黃酮樣品液150mL，通過(guò)改變上樣液流速（1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h）和上樣液質(zhì)量濃度（0.367 5 mg/mL、0.551 3 mg/mL、0.735 0 mg/mL）的試驗(yàn)，用分部收集器收集流出液，測(cè)定其吸光度，確定最適上樣流速和上樣液質(zhì)量濃度。

1.4.3.2 動(dòng)態(tài)洗脫

按相同上樣條件進(jìn)行吸附，上樣量為50 mL黃酮濃縮液用水稀釋成100 mL，吸附后用一定流速和90 mL一定體積乙醇進(jìn)行洗脫，分部收集測(cè)定其吸光度，通過(guò)改變洗脫流速（2 BV/h、3 BV/h）和乙醇體積濃度（50%、65%、80%）的試驗(yàn)，考察其適宜洗脫流速和洗脫液濃度。

1.4.3.3 工藝驗(yàn)證

按照以上確定的適宜工藝條件重復(fù)試驗(yàn)5次，得到全部洗脫液濃縮后凍干，再稱取一定量?jī)龈善啡苡谶m量乙醇,測(cè)定總黃酮吸光度，計(jì)算其得率和純度。

1.4.4 銀杏葉黃酮的抗氧化活性

1.4.4.1 銀杏葉黃酮對(duì)超氧陰離子的清除作用

取5份5 mL pH8.2 Tris-HCl緩沖液，分別加入提取液質(zhì)量濃度1/5、2/5、3/5、4/5和提取液5種不同質(zhì)量濃度銀杏葉黃酮溶液20 μL，再加5 μL 50 mmol·L-1鄰苯三酚，搖勻。以pH8.2 Tris-HCl緩沖液為空白對(duì)照，測(cè)定不同時(shí)間的吸光度，按式（4）計(jì)算抑制率。

式中：A0——空白吸光度；

A1——加黃酮樣液的吸光度。

1.4.4.2 銀杏葉黃酮清除羥自由基的作用

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測(cè)H2O2/Fe2+產(chǎn)生的羥自由基的方法考察銀杏葉黃酮對(duì)羥自由基的清除作用。取4支試管，分別加入0.75 mmol/L鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液1 mL、0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.40）2 mL、蒸餾水1 mL（第3支用0.735 mg/mL銀杏葉黃酮、第4支用0.5 mg/mLVc代替蒸餾水）、然后各加入0.75 mmol/L新配制硫酸亞鐵溶液1mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%新配制雙氧水1mL（其中第2支用溶液用1 mL蒸餾水代替雙氧水）。37℃水浴加熱60 min，在536 nm波長(zhǎng)測(cè)定的吸光度，測(cè)得各支試管的數(shù)據(jù)分別為：①損傷管的吸光值A(chǔ)損、②未損傷管吸光值A(chǔ)未、③銀杏葉黃酮樣品管吸光度A樣、④Vc陽(yáng)性對(duì)照管吸光度A陽(yáng)。按式（5）計(jì)算清除率。

1.4.4.3 小鼠常壓耐缺氧試驗(yàn)

昆明種小鼠隨機(jī)分為4組（n=6），分別為總黃酮高、中、低劑量組（分別為100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg）和空白對(duì)照組（等體積的生理鹽水）。連續(xù)灌胃給藥7 d后，把小鼠放入盛有5g鈉石灰的250 mL廣口瓶中，加蓋密封，以呼吸停止（小鼠胸部不起伏）為指標(biāo)，記錄小鼠死亡時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏葉提取液黃酮含量

按照1.3.2方法提取銀杏葉黃酮，提取液經(jīng)過(guò)濾、濃縮，測(cè)定提取液在波長(zhǎng)420 nm下的吸光度，按回歸方程計(jì)算得提取液黃酮質(zhì)量濃度為0.735 mg/mL。

2.2 銀杏葉黃酮適宜富集介質(zhì)的確定

據(jù)1.4.2方法篩選富集介質(zhì)，結(jié)果如表1。

由表1可看出各種吸附樹脂吸附性能大小比較為：D101＞HPD450＞HZ816＞AB-8＞ 聚酰胺樹脂；用體積濃度65%乙醇作為洗脫劑的解吸效果比較為：聚酰胺樹脂 ＞HPD450＞D101＞AB-8＞HZ816。由此可知，聚酰胺樹脂洗脫率最高，但是吸附效果并不理想；而HPD450的吸附效果只比D101略小，洗脫率也只比聚酰胺樹脂略小。綜合考慮，選擇HPD450大孔吸附樹脂作為銀杏葉黃酮的富集純化的適宜介質(zhì)。

2.3 HPD450樹脂對(duì)銀杏葉黃酮的純化條件選擇

2.3.1 吸附流速的確定

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 上樣流速對(duì)銀杏葉黃酮吸附的影響

由圖1可知，不同流速下漏出液黃酮的濃度值隨著上樣量的增大而增高，漏出點(diǎn)均在第4管附近；3 BV/h流速吸附效果較差，1 BV/h和2 BV/h條件下吸附率相近，而2 BV/h速率效果略好，節(jié)省時(shí)間。故適宜流速為2 BV/h。

2.3.2 上樣濃度的確定

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 上樣液濃度對(duì)銀杏葉黃酮吸附的影響

由圖2可看出用0.3675 mg/mL、0.5513 mg/mL、0.735 0 mg/mL3種不同質(zhì)量濃度黃酮溶液進(jìn)行上樣，上樣濃度越小則吸附率越高。故適宜上樣液濃度為0.3675mg/mL。

2.3.3 適宜洗脫流速的確定

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 流速對(duì)銀杏葉黃酮洗脫的影響

由圖3可知在3 BV/h和2 BV/h兩種不同洗脫流速的洗脫效果相當(dāng)，3 BV/h洗脫速率下波峰出現(xiàn)較早且高?？紤]到時(shí)間問(wèn)題，確定適宜洗脫流速為3 BV/h。

2.3.4 洗脫劑濃度的確定

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 乙醇體積濃度對(duì)銀杏葉黃酮洗脫的影響

由圖4可知，3種不同濃度乙醇作為洗脫劑時(shí)，都在使用50 mL乙醇洗脫后洗脫液黃酮含量顯著變??；體積濃度80%乙醇洗脫曲線峰形較好、無(wú)拖尾、洗脫集中；而體積濃度50%乙醇的效果較差，拖尾嚴(yán)重。故適宜洗脫劑為體積濃度80%乙醇溶液。

2.3.5 工藝驗(yàn)證結(jié)果

上樣液中銀杏葉總黃酮總量為1.766 g，銀杏葉總黃酮洗脫量分別為1.50 g、1.54 g、1.52 g、1.56 g、1.47 g，平均收集量為1.52 g，平均得率為86.1%；測(cè)定并計(jì)算得銀杏葉總黃酮純度為34.2%。說(shuō)明該工藝是可行的。

表2 不同濃度銀杏葉黃酮對(duì)超氧陰離子的抑制率

2.4 銀杏葉總黃酮抗氧化活性

2.4.1 對(duì)超氧陰離子的清除作用

每隔0.5 min測(cè)定一次吸光度，考察銀杏葉提取液對(duì)對(duì)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的清除作用，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，空白3 min時(shí)的自氧化率為0.076 7 A/min；隨著銀杏葉黃酮濃度的升高，其對(duì)超氧陰離子的抑制率也增高；提取液3 min時(shí)的氧化抑制率為45.63%。結(jié)果表明，銀杏葉黃酮對(duì)超氧陰離子的清除作用效果顯著。

2.4.2 對(duì)羥自由基的清除作用

通過(guò)鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測(cè)H2O2/Fe2+產(chǎn)生的羥自由基，考察銀杏葉提取液對(duì)羥自由基的清除作用，結(jié)果如表3。

表3 銀杏葉黃酮對(duì)H2O2/Fe2+產(chǎn)生的羥自由基的清除率

從表3可知0.735mg/mL銀杏葉黃酮對(duì)羥自由基的清除率為31.37%，效果明顯，且清除效果好于Vc。

2.4.3 銀杏葉黃酮對(duì)小鼠常壓缺氧的影響

小鼠耐缺氧試驗(yàn)結(jié)果如表4。

表4 不同濃度銀杏葉黃酮對(duì)小鼠耐常壓缺氧的影響

由表4可知，與生理鹽水對(duì)照組比較，黃酮低、中、高劑量組小鼠耐缺氧能力都有不同程度的改善，各劑量組間均有明顯差異，以高劑量組改善耐缺氧能力的效果最為明顯。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)選擇的D101、HPD450、HZ816、AB-8吸附樹脂吸附性都較強(qiáng)，其中樹脂HPD450吸附和洗脫效果最佳，其吸附率為98.87%，解析率為71.52%。故選擇大孔吸附樹脂HPD450作為銀杏葉黃酮的富集介質(zhì)。

考察了大孔樹脂HPD450富集黃酮的適宜工藝參數(shù)為：常溫2 BV/h、質(zhì)量濃度0.367 5 mg/mL上柱吸附，洗脫流速為3 BV/h，洗脫劑為50 mL體積濃度80%乙醇。此條件下得到銀杏葉總黃酮得率為86.1%，純度為34.2 g/100g。

抗氧化試驗(yàn)表明，銀杏葉黃酮對(duì)超氧陰離子自由基有明顯的抑制作用，并隨著其含量的增加而增加，且在一定范圍內(nèi)黃酮含量與抑制率呈正相關(guān)。銀杏葉黃對(duì)羥自由基的清除作用效果顯著。銀杏葉黃酮具有提高小鼠耐缺氧能力的作用。