汪克紅， 王開道， 田亞平

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

脯 氨 酸 氨 肽 酶 （prolyl aminopeptidase，PAP，EC3.4.11.5）是一類能特異地水解多肽或蛋白N-端脯氨酸殘基的氨肽酶，具有嚴(yán)格的底物特異性，在蛋白類食品水解加工產(chǎn)物苦味的去除[1]，膠原蛋白水解等方面都有著較好的應(yīng)用前景[2]。脯氨酸氨肽酶的來源廣泛，在動物[3]、植物和微生物中都有存在，但目前大多數(shù)報道的脯氨酸氨肽酶都來源于微生物[4-6]。

目前有關(guān)脯氨酸氨肽酶的研究主要集中在基因克隆、分離純化和性質(zhì)描述方面，而對脯氨酸氨肽酶的異源表達(dá)研究較少，表達(dá)量較低，無法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)[7]。Bacillus subtilis作為食品安全菌種[8]，由于其遺傳背景清晰，無致病性，蛋白分泌能力強(qiáng)，無密碼子偏好性以及發(fā)酵周期短等優(yōu)點已被廣泛用于外源基因的表達(dá)宿主[9-10]。本研究將前期從日式醬油成品曲中篩選到的米曲霉胞內(nèi)脯氨酸氨肽酶的cDNA基因克隆到枯草芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成提高胞外分泌量，從而為工業(yè)化生產(chǎn)脯氨酸氨肽酶奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

E.coli JM109、枯草芽孢桿菌WB600、穿梭質(zhì)粒pMA5、含目的基因的載體pMD19-pap。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。

TB培養(yǎng)基：蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，甘油4 g/L，17 mmol/L KH2PO4，72 mmol/L K2HPO4。

分泌培養(yǎng)基：蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，甘油 4 g/L，D-山梨醇 50 g/L，2 mmol/L CaCl2，17 mmol/L KH2PO4，72 mmol/L K2HPO4。

1.3 主要試劑

質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；所有的底物均購自瑞士Bachem公司；PrimeSTAR?DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；蛋白胨、酵母粉購自O(shè)xoid公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 酶活測定

以L-脯氨酸-對硝基苯胺為底物 （底物儲藏液用Tris-HCl 7.5配制，濃度為4.25 mmol/L），反應(yīng)體系包括2 mL Tris-HCl 7.5緩沖液，1 mL底物儲藏液和 1 mL稀釋后的酶液，50℃水浴 10 min，在405 nm處測定吸光值。50℃下每分鐘分解PropNA產(chǎn)生1 μmol/L對硝基苯胺所需的酶量為一個酶活單位（U）。

1.5 重組菌株的構(gòu)建

根據(jù)脯氨酸氨肽酶基因序列設(shè)計一對引物：上游引物 5'CGGGATCCATGGCTGCCAAAC 3'（BamHⅠ）；下游引物 5'CGCGACGCGTCTAATCAATAG AGTC 3'（MluⅠ），從載體 pMD19-pap 上擴(kuò)增含酶切位點的目的基因。將目的基因與質(zhì)粒pMA5分別用BamHⅠ和MluⅠ進(jìn)行雙酶切，膠回收純化后按一定比例混合在16℃金屬浴下連接12～16 h并轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)，涂布氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基，待長出轉(zhuǎn)化子后先經(jīng)菌落PCR初步驗證，將驗證正確的重組子提取質(zhì)粒雙酶切驗證后進(jìn)行測序。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化進(jìn)Bacillus subtilis WB600中得重組菌。

1.6 重組菌的發(fā)酵表達(dá)

將重組 Bacillus subtilis WB600（pMA5-pap）接種于50 mL含卡那抗性的TB培養(yǎng)基，37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。發(fā)酵結(jié)束后在4℃條件下8 000 r/min冷凍離心10 min，上清液進(jìn)行胞外酶活的測定。菌體沉淀用Tris-HCl 7.5的緩沖液洗滌兩遍后用相同體積的緩沖液重懸，菌懸液按照一定倍數(shù)稀釋超聲破碎后進(jìn)行胞內(nèi)酶活的測定。重組菌脯氨酸氨肽酶的表達(dá)情況用SDS-PAGE進(jìn)行檢測。

1.7 重組菌胞外分泌策略

通過對TB培養(yǎng)基成分的調(diào)整，增加胞外重組脯氨酸氨肽酶的分泌量。

1.8 重組脯氨酸氨肽酶分離純化

重組菌在分泌培養(yǎng)基中發(fā)酵結(jié)束后離心得到上清液，上清液經(jīng)硫酸銨鹽析后用50 mmol/L Tris-HCl 6.5緩沖液溶解，然后在此緩沖液中4℃透析過夜，透析后過膜（0.22 μm）作為離子交換層析上樣樣品。

Hitrap Q HP離子交換層析柱經(jīng)50 mmol/L Tris-HCl 6.5緩沖液平衡后，上樣1 mL，流速1 mL/min，控制NaCl的濃度為0.2、0.3和1 mol/L分三步階段洗脫各洗10個柱體積，每管收集0.5 mL洗脫液。

將酶活最高的幾管合并后用超濾管濃縮，濃縮液用于跑SuperdexTM 75 10/300 GL凝膠柱，上樣0.5 mL，流速 0.5 mL/min，50 mmol/L Tris-HCl 6.5 緩沖液進(jìn)行洗脫，每管收集0.5 mL。上述各部收集液進(jìn)行SDS-PAGE驗證其純度。

1.9 重組脯氨酸氨肽酶酶學(xué)性質(zhì)

將分離純化所得脯氨酸氨肽酶于不同pH值下測定其活性，以酶活最高者定義為100%，分別考察其最適pH和pH穩(wěn)定性。在不同的溫度下對重組脯氨酸氨肽酶的酶活進(jìn)行測定以確定其最適反應(yīng)溫度，將其在系列溫度下保溫1 h后用1.4節(jié)所述方法測定剩余酶活力，以4℃保溫的為100%以確定其溫度穩(wěn)定性。

將純酶液與相應(yīng)濃度的金屬離子MnCl2、MgCl2、ZnSO4、CuSO4、CoCl2、NiSO4及 蛋 白 酶 抑 制 劑PMSF、DTT、β-巰基 乙醇 和 EDTA 在 50 mmol/L Tris-HCl 7.5緩沖液中30℃溫浴30 min后用標(biāo)準(zhǔn)方法測定剩余活性以考察金屬離子及蛋白酶抑制劑對重組脯氨酸氨肽酶的影響。

將純酶液分別與 0.5 mol/L 的 NaCl，KCl，Na2SO4和K2SO4（溶于50 mmol/L Tris-HCl 7.5緩沖液中）30℃溫浴30 min后用標(biāo)準(zhǔn)方法測定酶活以考察鹽的種類對重組脯氨酸氨肽酶的影響，在0～4.36 mol/L NaCl下考察其耐鹽性。

分 別 配 置 Lys-pNA，Leu-pNA，Ala-pNA，Met-pNA，Ile-pNA，Val-pNA，Arg-pNA 和 Pro-pNA以考察其底物特異性，以酶活最高者為100%。以不同濃度的L-脯氨酸-對硝基苯胺為底物 （0.2～1.4 mmol/L），用標(biāo)準(zhǔn)方法測定酶活，利用雙倒數(shù)作圖法計算重組脯氨酸氨肽酶的米氏常數(shù)Km及其最大反應(yīng)速率Vmax。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌株的構(gòu)建

根據(jù)脯氨酸氨肽酶cDNA序列設(shè)計引物，將脯氨酸氨肽酶基因從載體pMD19-pap上擴(kuò)增了下來，兩端分別帶上了BamHⅠ和MluⅠ酶切位點。按1.5節(jié)所述方法構(gòu)建重組質(zhì)粒，其雙酶切驗證結(jié)果如圖1所示，重組質(zhì)粒切出了大、小兩條帶，其大小分別與空質(zhì)粒和脯氨酸氨肽酶PCR產(chǎn)物相對應(yīng)，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒送上海生工測序，測序結(jié)果與脯氨酸氨肽酶cDNA序列一致，表明序列沒有發(fā)生突變。將重組質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)儀在12.5 kV/cm，25 μF，200 Ω，4.5～5.0 ms 條件下電轉(zhuǎn)化進(jìn)Bacillus subtilis WB600，并在卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基上挑選重組子，重組子經(jīng)PCR快速驗證和雙酶切驗證后表明已構(gòu)建成功，該重組菌用于脯氨酸氨肽酶發(fā)酵表達(dá)。

圖1 重組質(zhì)粒雙酶切驗證Fig.1 Identification of the recombinant plasmid by BamH I and Mlu I

2.2 重組菌發(fā)酵表達(dá)

重組 Bacillus subtilis WB600（pMA5-pap）按 1.6節(jié)所述方法進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)后，測得其胞外酶活的值為7.5 U/mL，胞內(nèi)酶活為40.0 U/mL，SDS-PAGE驗證結(jié)果見圖2，由圖可以看出在50 kDa處出現(xiàn)了明顯的蛋白條帶，表明脯氨酸氨肽酶在枯草芽孢桿菌中成功實現(xiàn)了表達(dá)。由表達(dá)結(jié)果看出，雖然有一部分脯氨酸氨肽酶分泌到了胞外，但分泌量較少，大多數(shù)還集中在胞內(nèi)，不利于工業(yè)化生產(chǎn)和制備，因此后續(xù)將采用一定的手段提高胞外表達(dá)量從而簡化純化步驟。

圖2 重組脯氨酸氨肽酶表達(dá)SDS-PAGE驗證Fig.2 SDS-PAGE analysisofrecombinantprolyl aminopeptidase expression

2.3 重組脯氨酸氨肽酶胞外分泌

由于該脯氨酸氨肽酶自身為胞內(nèi)酶，前期也嘗試過加信號肽，但信號肽的添加導(dǎo)致其不能正常表達(dá)，因此本研究采用在培養(yǎng)基中添加滲透劑的方法改變細(xì)胞膜的通透性以提高胞外分泌量。前期通過實驗探索發(fā)現(xiàn)D-山梨醇和CaCl2對胞外分泌有促進(jìn)作用，因此進(jìn)一步對該兩種物質(zhì)的添加量做了研究，其結(jié)果如表1所示，綜合考慮對細(xì)胞生長的影響確定5%為D-山梨醇的最適添加量，當(dāng)CaCl2的最終濃度為2 mmol/L時脯氨酸氨肽酶的胞外分泌量達(dá)到最大為36.0 U/mL，相比于TB培養(yǎng)基時（7.5 U/mL）提高了4.8倍。

表1 培養(yǎng)基組成對胞外酶活的影響Table 1 Effect of medium composition on extracellular enzyme activity

2.4 胞外脯氨酸氨肽酶的純化

采用分泌培養(yǎng)基對重組菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后離心得上清發(fā)酵液，發(fā)酵液按1.8節(jié)所述方法進(jìn)行純化，所用硫酸銨鹽析的飽和度為40%～50%，純化結(jié)果如表2所示，由表可知，最終純化所得脯氨酸氨肽酶的比酶活為247.3 U/mg，純化倍數(shù)為8.8倍，收率為1.7%。各步純化的SDS-PAGE驗證結(jié)果如圖3所示，由圖可以看出經(jīng)superdex純化后重組脯氨酸氨肽酶達(dá)到了電泳純。

表2 重組脯氨酸氨肽酶純化結(jié)果Table 2 Purification of recombinant prolyl aminopeptidase

圖3 重組脯氨酸氨肽酶各步純化SDS-PAGE驗證Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified prolyl aminopeptidase

2.5 重組脯氨酸氨肽酶的酶學(xué)性質(zhì)

該脯氨酸氨肽酶在枯草芽孢桿菌中重組表達(dá)后其基本酶學(xué)性質(zhì)變化不大，在50℃時表現(xiàn)出最大的催化活性，在50℃及以下保溫后剩余酶活仍有75%以上，當(dāng)60℃保溫1 h后活性基本喪失，說明該酶對高溫的耐受性還有待提高[11]。該酶的最適pH值為7.5，與來源于Debaryomyces hansenii（pH 7.5），Penicillium camemberti（pH 7.0）和 Arthrobacter nicotianae 9458（pH 8.0）的脯氨酸氨肽酶的最適pH相近[5，12-13]，在 pH 6～11 之間穩(wěn)定，在酸性環(huán)境中酶活喪失嚴(yán)重。在金屬離子當(dāng)中，只有ZnSO4和CuSO4對該酶有較強(qiáng)的抑制作用，在1 mmol/L的濃度下30℃保溫30 min后相對酶活僅為2%和5%。該酶為非金屬依賴型酶，也不含二硫鍵，因此EDTA和β-巰基乙醇對酶活性均沒有影響。

研究發(fā)現(xiàn)該酶具有一定的耐鹽性，首先考察了幾種鹽類對酶活性的影響，結(jié)果如圖4所示，由圖可以看出一定濃度的鹽不但對該酶沒有抑制作用，反而還有一定的激活作用，且這種激活作用與鹽的種類關(guān)系不大。進(jìn)一步用NaCl考察了該酶的耐鹽性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)NaCl的濃度達(dá)到4.36 mol/L時仍有109.5%的相對酶活，說明該酶能耐受較高的鹽濃度。脯氨酸氨肽酶的這種耐鹽性在別的菌株里也有過報道，Uraji等人[14]發(fā)現(xiàn)來源于 Streptomyces aureofaciens TH-3的脯氨酸氨肽酶能耐受4 mol/L的NaCl，且推測脯氨酸氨肽酶的這種耐鹽機(jī)制可能與其N端氨基酸殘基的疏水作用有關(guān)，Matsushita-Morita等人[15]報道的米曲霉脯氨酸氨肽酶也具有一定的耐鹽性，其鹽濃度也能達(dá)到4 mol/L，F(xiàn)ukuuchi等人[16]對嗜鹽菌里蛋白的氨基酸組成進(jìn)行了研究，指出蛋白表面的酸性殘基可能有助于其適應(yīng)高鹽環(huán)境，且過多的具有較小pKa值的天冬氨酸的存在會導(dǎo)致其在高鹽濃度下帶電形式的酸性殘基增加。利用該特性在一些酶解過程中可適量提高鹽濃度以更好地發(fā)揮酶活性[17]。另外由于米曲霉自身產(chǎn)的脯氨酸氨肽酶只存在于胞內(nèi)且含量甚微，如果額外添加適量氨肽酶與醬油曲復(fù)合使用可提高醬油中氨基酸含量并獲得更好的風(fēng)味。

圖4 鹽種類對重組脯氨酸氨肽酶的影響Fig.4 Effects of several salts on recombinant prolyl aminopeptidase activity

通過對8種AA-pNA進(jìn)行水解，其結(jié)果如圖5所示，說明該酶只對Pro-pNA有水解作用，而對其他幾種底物均無水解作用，說明該酶對脯氨酸具有嚴(yán)格的底物特異性。用L-脯氨酸-對硝基苯胺為底物，重組脯氨酸氨肽酶的動力學(xué)方程如圖6所示，根據(jù)圖中方程計算得米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax分別為 0.171 mmol/L 和 55.99 μmol/（L·min），與大腸桿菌表達(dá)的重組脯氨酸氨肽酶（Km和Vmax分別為 0.06 mmol/L 和 28.70 μmol/（L·min）） 相比[18]，雖然其對底物親和力有所降低，卻表現(xiàn)出更高的催化效率。

圖5 重組脯氨酸氨肽酶的底物特異性Fig.5 Substrate specificity of recombinant prolyl aminopeptidase

圖6 重組脯氨酸氨肽酶Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖Fig.6 Lineweaver-Burk plot of recombinant prolyl aminopeptidase

3 結(jié) 語

本研究成功實現(xiàn)了脯氨酸氨肽酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)，并通過分泌培養(yǎng)基大大提高了胞外表達(dá)量，相比于大腸桿菌其安全性、胞外分泌能力、以及表達(dá)量均有所提高。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，各種不同類型的氨肽酶的應(yīng)用和需求也越來越廣泛，除了用于蛋白水解和改善風(fēng)味之外，在醫(yī)療診斷與檢測、蛋白測序等領(lǐng)域也發(fā)揮著日益重要的作用。后續(xù)通過帶標(biāo)簽表達(dá)簡化純化過程，優(yōu)化放大發(fā)酵條件可實現(xiàn)脯氨酸氨肽酶的生產(chǎn)。