石建喜， 許艷順， 姜啟興， 盧素芳， 夏文水

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖北 武漢 430207）

我國是漁業(yè)大國，2014年水產(chǎn)品總產(chǎn)量6 172.00萬t，其中養(yǎng)殖淡水魚類總產(chǎn)量2 481.73萬t，但是我國淡水魚加工比例仍較低，不足15%，嚴重制約了我國淡水漁業(yè)的發(fā)展。鰱魚作為產(chǎn)量僅次于草魚的淡水魚類，肉質(zhì)鮮嫩，營養(yǎng)豐富，但由于其肉薄刺多、土腥味較重的問題，導(dǎo)致鰱魚的消費量受到極大限制。腌制發(fā)酵是一種水產(chǎn)品傳統(tǒng)保藏加工技術(shù)，腌制發(fā)酵過程中，產(chǎn)品的理化特性、微生物群以及感官特性發(fā)生變化，最終引起產(chǎn)品風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)、色澤以及其他品質(zhì)特征的改善，以更好地滿足消費者需求。但由于傳統(tǒng)發(fā)酵都是利用自然界的微生物在適宜的溫濕條件下發(fā)酵而成，發(fā)酵過程難以控制[1]。

近年來，利用現(xiàn)代微生物接種技術(shù)提升傳統(tǒng)發(fā)酵魚制品品質(zhì)已引起廣泛關(guān)注，將自傳統(tǒng)發(fā)酵制品分離的菌種接種到產(chǎn)品中，能夠縮短產(chǎn)品的生產(chǎn)周期和提高安全性。微生物發(fā)酵菌種以及發(fā)酵工藝條件對最終產(chǎn)品風(fēng)味和食用品質(zhì)有著重要影響。本研究室前期以鰱魚為原料，采用單一和混合發(fā)酵劑對淡水魚糜進行發(fā)酵，得到了具有獨特風(fēng)味、高凝膠強度的發(fā)酵魚糜制品[2-6]；Adams等人[7]研究了乳酸菌發(fā)酵魚糜的影響因素，發(fā)現(xiàn)隨含鹽量增加pH降低速率減緩；現(xiàn)有研究主要針對發(fā)酵菌種篩選、魚糜發(fā)酵過程中品質(zhì)變化方面，對微生物接種發(fā)酵、鹽含量對發(fā)酵魚塊品質(zhì)以及風(fēng)味的影響還鮮有報道。

因此，本研究選用從傳統(tǒng)發(fā)酵魚制品中篩選出的植物乳桿菌120、釀酒酵母152、木糖葡萄球菌135作為混合發(fā)酵劑在20℃條件下發(fā)酵鰱魚塊，比較分析兩種鹽濃度條件下魚肉理化、微生物及風(fēng)味品質(zhì)變化，為利用現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)提升傳統(tǒng)腌制魚制品風(fēng)味品質(zhì)和安全性提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 鰱魚：鮮活，購于無錫市華潤萬家超市，質(zhì)量2.5±0.2 kg，去除頭、內(nèi)臟，用清水沖洗干凈后切成長、寬、厚為 5±0.2 cm×5±0.2 cm×2±0.2 cm的魚塊。

菌種：植物乳桿菌120、釀酒酵母152、木糖葡萄球菌135分離于自然發(fā)酵酸魚，均由江南大學(xué)食品學(xué)院提供。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 分光光度計：UV2100型，上海尤尼柯儀器公司；冷凍離心機：4K15型，SIGMA公司；均質(zhì)機：T10型，廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司；氣相質(zhì)譜連用儀：QP2010 plus型，日本島津公司；電子分析天平：AB104-N型，梅特勒-托利多儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱：HH-B11.420-BS型，上海躍進醫(yī)療器械廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱：GZXGF101-1BS型，上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵鰱魚的制備 實驗分4組：①鹽質(zhì)量分數(shù)5%；②鹽質(zhì)量分數(shù)3%；③鹽質(zhì)量分數(shù)5%，加1%混合發(fā)酵劑；④鹽質(zhì)量分數(shù)3%，加1%混合發(fā)酵劑?；旌习l(fā)酵劑植物乳桿菌120、釀酒酵母152、木糖葡萄球菌135添加比例為1∶1∶1。4組實驗均加入質(zhì)量分數(shù)1%的葡萄糖做碳源，在20℃發(fā)酵48 h。

1.2.2 混合發(fā)酵劑的制備 將菌種植物乳桿菌120、釀酒酵母152和木糖葡萄球菌135分別接種在不同的培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，重復(fù)操作3次。將培養(yǎng)的菌種菌液于4℃、10 000 r/min離心10 min，然后用無菌生理鹽水洗滌兩次，再懸浮于無菌生理鹽水中。最后將菌液濃度調(diào)整到105～106cfu/mL，將菌液于4℃保存，并于24 h內(nèi)使用。

1.2.3 微生物分析 取25 g樣品于無菌均質(zhì)袋中，加入225 mL無菌生理鹽水，用均質(zhì)拍打器均質(zhì)3 min。吸取上清液1 mL，將樣品等梯度稀釋。選擇3個合適稀釋度，每個稀釋度取0.1 mL分別加入不同的選擇性培養(yǎng)基中，采用稀釋涂布的方法對微生物計數(shù)。菌落總數(shù)用平板計數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2 d；乳酸菌用MRS培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)2 d；酵母菌用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)36 h；葡萄球菌用高鹽甘露醇瓊脂（MSA）培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)2 d；假單胞菌用CFC選擇培養(yǎng)基于26℃培養(yǎng)72 h；腸桿菌用結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBA）雙層培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.4 pH值的測定 精確稱取10 g魚肉，加100 mL蒸餾水用高速分散機勻漿1 min，勻漿結(jié)束后立即用pH計測定勻漿物的pH值，重復(fù)測定3次。

1.2.5 總酸含量的測定 參照Ikenebomeh法[8]，總酸度用乳酸表示。

1.2.6 揮發(fā)性鹽基氮（TVBN）含量的測定 按照國標(biāo)GB/T2003稍微修改進行測定。

1.2.7 氨基態(tài)氮（ANN）含量的測定 采用甲醛滴定法[9]。

1.2.8 脂質(zhì)氧化的測定 用硫代巴比妥酸（TBA）表示氧化酸敗的程度。取2 g碎肉，加入20 mL 10%三氯乙酸溶液高速均質(zhì)30 s，4℃2 000 g離心5 min，將上清液進行過濾，取過濾液5 mL與5 mL 0.02 mol/L TBA溶液混合，沸水浴加熱20 min，迅速冷卻20 min，在532 nm處測吸光值?？瞻子? mL三氯乙酸溶液與5 mL TBA溶液混合。TBA值用丙二醛（MDA）質(zhì)量分數(shù)表示，單位為mgMDA/kg樣品。

1.2.9 GC-MS測定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì) （1）揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的提取。采用固相微萃取的方法提取風(fēng)味物質(zhì)。取魚肉2 g，萃取溫度為50℃，萃取時間為60 min。將萃取頭插入氣相色譜進樣口250℃解析3 min，取樣3次，進行平行操作。（2）GC-MS測定。氣相色譜條件：彈性毛細管柱 （30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣氦氣流量為 0.81 mL/min，不分流進

圖1 不同發(fā)酵條件下鰱魚發(fā)酵過程中微生物的變化Fig.1 Microbiological changes in sliver carp during fermentation under different condition

樣，進樣口溫度維持250℃。起始柱溫40℃維持3 min，然后以5℃/min升溫至120℃，保持5 min，再以15℃/min升溫至240℃，保持5 min。質(zhì)譜條件：離子源溫度200℃，四級桿溫度150℃，電子電壓70 eV。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用Origin 8.5統(tǒng)計作圖，利用SPASS 22.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 鰱魚發(fā)酵過程中微生物變化

鰱魚發(fā)酵過程中微生物的變化見圖1。微生物是影響發(fā)酵鰱魚最終品質(zhì)的重要因素，本實驗主要對菌落總數(shù)、乳酸菌、酵母菌、葡萄球菌、腸桿菌以及假單胞菌等6種菌種進行了分析。由于鹽質(zhì)量分數(shù)較低，在3%～5%的含鹽量范圍內(nèi)，鹽質(zhì)量分數(shù)對微生物生長的影響并不明顯。

由圖1（a）可知，隨著發(fā)酵的進行，0～24 h菌落總數(shù)快速增加，24～48 h增長速度變緩，說明后期乳酸菌代謝產(chǎn)生的有機酸、細菌素等抑菌物質(zhì)對微生物的增長產(chǎn)生了抑制作用。發(fā)酵初期，由于發(fā)酵劑直接注射入發(fā)酵液中，因此接種組與對照組的差異并不是很明顯。但乳酸菌（圖1（b））隨著發(fā)酵時間的增加而增加，對照組的乳酸菌數(shù)明顯低于接種混合發(fā)酵劑組，接種組發(fā)酵24 h時菌落數(shù)對數(shù)值已達到7.58～8.46，而對照組在36 h時最高僅為8.45，接種組在36 h時已達到9.36～9.59。且乳酸菌與總菌數(shù)變化趨勢相似，因此推斷乳酸菌為鰱魚發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌。

酵母菌和葡萄球菌對鰱魚風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要作用。由于接種組中加入酵母菌，所以發(fā)酵前12 h，增長速度較對照組迅速，直至24 h時，接種組增速開始減緩；48 h時數(shù)量差異已不是很明顯（圖1（c））。酵母菌可以通過消耗過氧化物和氧氣來抑制亞硝基肌紅蛋白的降解和產(chǎn)品的腐敗[10]。

接種組中葡萄球菌數(shù)量高于對照組，接種組和對照組均維持快速增長，當(dāng)?shù)竭_24 h時，接種組開始出現(xiàn)明顯下降趨勢，對照組雖在增加卻速度變緩，這可能是由于pH的降低造成的，因為在存在耐酸細菌的環(huán)境中，葡萄球菌競爭性相對較弱[11]且酸度的增強抑制了葡萄球菌的生長。

腸桿菌、假單胞菌是發(fā)酵魚產(chǎn)品中的致病菌，所以對產(chǎn)品安全有重要的影響。發(fā)酵前12 h，假單胞菌數(shù)量在3.5～3.6，腸桿菌數(shù)量在2.2～2.6，由于營養(yǎng)物質(zhì)豐富，腸桿菌和假單胞菌迅速增加，但隨著時間延長，乳酸菌等優(yōu)勢菌的快速增長使其生長受到競爭，且pH的降低也不利于其生長，削弱了有害菌的生長環(huán)境，因此發(fā)酵至36 h時均有先增長迅速后增長平緩的趨勢。繼續(xù)發(fā)酵，實驗組中腸桿菌、假單胞菌和葡萄球菌出現(xiàn)明顯降低，推測是受pH值以及抑菌物質(zhì)的影響產(chǎn)生的。

2.2 添加混合發(fā)酵劑對理化指標(biāo)的影響

2.2.1 鰱魚發(fā)酵過程中pH值和總酸含量（TA）的變化 pH值和TA的變化如圖2所示，發(fā)酵初期，魚肉pH值均在6.5～6.8。隨著發(fā)酵時間的增加，0～12 h pH值和TA值變化較為緩慢，24 h時pH值明顯下降，TA值上升，由此可知微生物在此時間范圍內(nèi)生長迅速，使pH值迅速下降，抑制有害微生物的生長。發(fā)酵48 h時，接種組的pH值明顯低于對照組，當(dāng)接種組pH值為4.23～4.44時，對照組的pH仍保持在5左右，說明加入混合發(fā)酵劑后發(fā)酵時間明顯縮短，且pH的降低伴隨著明顯的TA值升高，與前面的乳酸菌的增長相一致。3%和5%食鹽含量的兩接種組，前者pH值變化更明顯。

圖2 不同發(fā)酵條件下鰱魚發(fā)酵過程中pH和TA的變化Fig.2 pH andTA changesin slivercarp during fermentation under different conditions

2.2.2 鰱魚發(fā)酵過程中揮發(fā)性鹽基氮（TVBN）的變化 由圖3可知，不論在何種發(fā)酵條件下，隨著發(fā)酵時間的增加，TVBN值均增加；48 h時，接種組質(zhì)量分數(shù)分別為0.188 7和0.192 2 mg/g，對照組質(zhì)量分數(shù)分別為0.232 1和0.254 5 mg/g，已開始出現(xiàn)腐敗特征。根據(jù)微生物生長情況可知，乳酸菌的快速生長降低了pH，并產(chǎn)生其他抑菌物質(zhì)，明顯抑制腐敗菌的生長，并抑制TVBN的增加。兩接種組間雖最后差別不是很大，但5%食鹽質(zhì)量分數(shù)組TVBN增長速度明顯較3%食鹽組快。

圖3 不同發(fā)酵條件下鰱魚發(fā)酵過程中TVBN的變化Fig.3 TVBN changes in sliver carp during fermentation under different conditions

2.2.3 鰱魚發(fā)酵過程中氨基態(tài)氮 （ANN）的變化氨基態(tài)氮含量可以反映發(fā)酵魚肉的蛋白水解程度。由圖4可知接種混合發(fā)酵劑的發(fā)酵魚肉的ANN含量均高于對照組，除了因pH值的降低提高魚肉中的酸性蛋白活性外，與乳酸菌和木糖葡萄球菌本身產(chǎn)生的蛋白酶也有很大的關(guān)系。

圖4 不同發(fā)酵條件下鰱魚發(fā)酵過程中ANN的變化Fig.4 ANN changes in sliver carp during fermentation under different conditions

2.2.4 鰱魚發(fā)酵過程中硫代巴比妥酸（TBARS）的變化 TBARS是衡量脂肪氧化程度的指標(biāo)之一。由圖5可知，發(fā)酵初期魚肉中TBARS值為0.24～0.26 mg/kg，隨著發(fā)酵時間的延長TBARS顯著增加，接種組中由于優(yōu)勢菌種的作用，明顯低于對照組。添加混合發(fā)酵劑的兩組最高為2.322 mg/kg，而對照組最低為3.225 mg/kg，最高達到3.412 mg/kg，說明混合發(fā)酵劑明顯抑制TBARS的增長。在此發(fā)酵時間內(nèi)，發(fā)酵魚肉中TBARS含量低于丙二醛限量值5 mg/kg[12]。

圖5 不同發(fā)酵條件下鰱魚發(fā)酵過程中TBARS的變化Fig.5 TBARS changes in sliver carp during fermentation under different conditions

2.3 不同發(fā)酵條件下?lián)]發(fā)性風(fēng)味成分的分析

魚肉發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)對魚肉產(chǎn)品的最終品質(zhì)有重要影響。圖6表示了不同發(fā)酵條件下發(fā)酵鰱魚揮發(fā)性風(fēng)味成分及其相對含量的變化?？瞻讓φ战M （A、B）分別檢測出風(fēng)味化合物種類為31和41種；接種混合發(fā)酵劑組（C、D）分別檢測出揮發(fā)性風(fēng)味化合物種類為65和65種。

圖6 不同發(fā)酵條件下發(fā)酵鰱魚的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化Fig.6 Changesofvolatility in sliver carp during fermentation under different conditions

發(fā)酵過程中酵母菌對醇類化合物的生成貢獻最大；并且3%的鹽質(zhì)量分數(shù)更有利于醇類的生成。另外，盡管醇類物質(zhì)中3-甲基-1-丁醇、1-辛醇和1-壬醇含量相對較高，但由于其閾值較高，對風(fēng)味的影響較小，而1-辛烯-3-醇因其較小的風(fēng)味閾值且具有蘑菇香而對風(fēng)味具有重要的貢獻。

碳氫化合物是所有揮發(fā)性風(fēng)味成分中質(zhì)量分數(shù)最多的物質(zhì)，且各組之間的差距并不明顯，占到總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的45%左右，但由于其閾值較高，因此其對風(fēng)味的影響較小。

醛類物質(zhì)由于較小的閾值對食品風(fēng)味具有重要的貢獻。根據(jù)醛類的來源可將醛分為脂質(zhì)氧化醛和氨基酸降解醛[13]。己醛、辛醛和壬醛等直鏈醛主要是不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)生，支鏈醛主要來自氨基酸降解。發(fā)酵鰱魚中的醛類化合物主要包3-甲基丁醛、庚醛、壬醛，其中支鏈醛3-甲基丁醛相對含量最高，對風(fēng)味的貢獻較大[14]。

酮類形成主要來自于脂質(zhì)的氧化和Strecker反應(yīng)而發(fā)生的氨基酸降解?；旌辖臃N組（C、D）的酮類化合物明顯高于對照組，這可能是由于葡萄球菌促進酮類風(fēng)味物質(zhì)的生成。單個酮類物質(zhì)中，變化最明顯的是2-甲基-3-辛酮。2-酮 （3，5-辛二烯-2-酮）由于具有特殊的香味[15]，因此被認為對肉產(chǎn)品風(fēng)味具有重要作用。

酸、酯和芳香烴的揮發(fā)性化合物質(zhì)量分數(shù)相對較低。接種混合發(fā)酵劑組（C、D）的酸類化合物質(zhì)量分數(shù) （6.38%～7.76%）明顯高于對照組 （2.69%～3.06%），這主要是由于魚肉發(fā)酵過程中乳酸菌產(chǎn)酸的原因。其中酸類化合物中乙酸質(zhì)量分數(shù)相對較高。接種組的酯類質(zhì)量分數(shù)分別為（3.6%～4.41%），高于對照組（3.09%～3.11%），說明接種微生物有利于酯類物質(zhì)的生成。芳香烴中只檢測出一種呋喃（2-戊基呋喃），所占比例約為0.2%～0.7%，研究表明，2-戊基呋喃是由亞油酸和n-6脂肪酸衍生而來[16]，且由于閾值相對較低，因此對風(fēng)味形成有重要貢獻。

3 結(jié)語

（1）魚肉混合接種發(fā)酵過程中乳酸菌快速生長，導(dǎo)致魚肉pH值48 h內(nèi)降到4.5以下，有效抑制了魚肉中腸道菌、葡萄球菌和假單胞菌的生長繁殖以及TVBN和TBARS的積累。

（2）采用微生物混合接種發(fā)酵技術(shù)可改善魚肉風(fēng)味，相較對照組，接種組中酯類、酮類和酸類香氣增加較為明顯；其中乙酸、己醇、1-辛烯-3-醇、3，5-辛二烯2-酮、3-甲基丁醛是主要的風(fēng)味物質(zhì)。

（3）在3%～5%的食鹽質(zhì)量分數(shù)范圍內(nèi)，鹽含量對發(fā)酵魚肉理化及風(fēng)味品質(zhì)沒有顯著影響。