梁娟，劉越，尹新華*

(1. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150001； 2. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，哈爾濱 150001)

美國流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是目前世界上最常見的導(dǎo)致人類死亡的原因，占全球總死亡人數(shù)的31.5%[1]。在我國，最新流行病學(xué)證據(jù)也表明CVD患病率及死亡率仍處于上升階段，而心血管死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，農(nóng)村為45.01%，城市為42.61%[2]。因此，CVD是世界公共衛(wèi)生及健康事業(yè)所面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，亟需進(jìn)一步臨床與基礎(chǔ)研究。動(dòng)物模型一直是心血管基礎(chǔ)研究常被用到的方法，用于揭示疾病的發(fā)病機(jī)制和觀察干預(yù)的效果。ISO是一種β-腎上腺素能受體激動(dòng)劑，通過加快心率、增強(qiáng)心肌耗氧量引發(fā)心肌損傷，其發(fā)病機(jī)制主要與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬和凋亡等機(jī)制有關(guān)，表現(xiàn)出許多與人類心臟病相似的代謝和形態(tài)學(xué)異常，模擬缺血性心肌損傷、藥物性心肌損傷、2型心肌梗死等疾病[3]。因此，本文從形態(tài)與功能學(xué)特征、發(fā)病機(jī)理等方面闡述ISO所致的動(dòng)物心肌損傷模型，從而有助于深入理解其在基礎(chǔ)研究中應(yīng)用的意義。

1 ISO誘導(dǎo)心肌損傷動(dòng)物模型的形態(tài)與功能學(xué)特征

ISO所致心肌損傷的動(dòng)物模型包括輕度心肌損傷、心肌梗死、心肌肥厚甚至心力衰竭等。根據(jù)ISO給藥的劑量和持續(xù)時(shí)間分為三種情況：低劑量ISO所致心肌損傷模型，例如心肌肥厚，多用5 mg/(kg·bw)，時(shí)間至少1周，多至4周；中等劑量ISO所致心肌梗死模型，通常用ISO 10 ～ 120 mg/(kg·bw)連續(xù)兩次或多次皮下注射方式；高劑量ISO所致心肌梗死模型，ISO 150 ～ 400 mg/(kg·bw)以單次劑量或連續(xù)兩次施用。高等劑量ISO所致心肌梗死模型的成模率高于中等劑量ISO，但同時(shí)伴隨著更高的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率。

1.1 低劑量ISO所致心肌損傷模型

低劑量ISO 5 mg/(kg·bw)作用7 d或14 d可誘導(dǎo)以心肌纖維化和壞死為特征的心肌肥厚模型。在ISO 5 mg/(kg·bw)皮下注射7 d后24 h，雄性Wistar大鼠(2 ～ 3月齡，n=7，來自斯洛伐克共和國的Dobra’Voda育種站)體內(nèi)心臟和離體心臟模型的心電圖檢查發(fā)現(xiàn)體內(nèi)心臟的QRS時(shí)間和QT間期分別延長了8%和53%，I導(dǎo)聯(lián)可見R波振幅增加，部分出現(xiàn)ST-T改變，而離體心臟R波振幅較體內(nèi)心臟更高，QT間期延長了55%。一般認(rèn)為，QT間期延長為復(fù)極異常的表現(xiàn)，與室性心律失常風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。ISO組大鼠的離體心臟中，室性早搏數(shù)量較正常組離體心臟明顯增多[4]。同時(shí)，ISO 5 mg/(kg·bw)腹腔注射7 d后雄性SD大鼠(140 ～ 160 g，來自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)心臟重量顯著增加，血清BNP及其在心臟中的mRNA表達(dá)水平升高[5]。而且，ISO 5 mg/(kg·bw)腹腔注射7 d的雄性Wistar大鼠(180 ～ 200 g，n=6，來自沙特國王沙特大學(xué)藥劑學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)的血漿cTnI和CK-MB水平顯著升高，進(jìn)一步的心肌組織HE染色發(fā)現(xiàn)左心室局灶性心內(nèi)膜下退化，伴有許多單核細(xì)胞浸潤灶；而Masson染色可見左心室心肌細(xì)胞特別是在內(nèi)皮下區(qū)域的肌內(nèi)膜中有較多的纖維組織沉積[6]。與之一致，在5 mg/(kg·bw)皮下注射14 d誘導(dǎo)的雄性SD大鼠(200 ～ 250 g，n=10，來自印度海得拉巴的蒂娜實(shí)驗(yàn)室)中，在實(shí)驗(yàn)第13天的心電圖上呈現(xiàn)心率加快、QT間期延長和R波振幅增加。同時(shí)ISO組大鼠心肌組織中ANP、β-MHC及膠原mRNA的表達(dá)量較鹽水對(duì)照組顯著增加[7]。上述現(xiàn)象表明腎上腺素能過度激活導(dǎo)致心肌損傷壞死、纖維化進(jìn)而發(fā)生心肌肥厚，同時(shí)伴隨著心臟功能下降。

1.2 中等劑量ISO所致心肌損傷模型

通常以連續(xù)兩次或多次劑量給予中等ISO建立嚙齒類動(dòng)物的急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)模型。在中等劑量的ISO 85 mg/(kg·bw)皮下注射2 d干預(yù)的成年雄性Wistar大鼠(170 ～ 200 g，n=10，來自印度新德里醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院中心畜舍設(shè)施)中，血清CK-MB和LDH水平顯著增加；組織病理學(xué)檢查顯示心肌明顯水腫，伴炎癥改變及壞死；超微結(jié)構(gòu)檢查示心肌細(xì)胞線粒體腫脹和嵴的空泡化破壞[8]。值得一提的是，有文章報(bào)道采用ISO劑量梯度遞減法并延長給藥時(shí)間方式誘導(dǎo)的心肌梗死模型較ISO 85 mg/(kg·bw)短期給藥方式更穩(wěn)定，而且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存率更高[9]。研究發(fā)現(xiàn)即使ISO代謝清除后損傷的心肌仍會(huì)繼續(xù)發(fā)生重塑，導(dǎo)致心肌肥厚、心室擴(kuò)張和心臟功能障礙，這些改變與ISO給藥劑量成正比[10]，甚至可能在ISO給藥后9周仍有心電圖變化、纖維化進(jìn)展和TNF水平升高[11]。與之相反，Shao等[10]報(bào)道中等劑量ISO 50～100 mg/(kg·bw)所致的心肌損傷是一個(gè)可逆過程，但仍有待進(jìn)一步研究。

1.3 高劑量ISO所致心肌損傷模型

高劑量的ISO 150～340 mg/(kg·bw)誘導(dǎo)彌漫性心肌壞死，甚至誘發(fā)惡性心律失常。有研究報(bào)道單劑量ISO 200 mg/(kg·bw)皮下注射給藥后24 h血清CK-MB和cTnI水平分別升高為對(duì)照組的2～3倍和15～20倍[12]。有意思的是， Markus等[13]給予野生型C57BL/6小鼠(10～12周齡，來自美國緬因州巴爾港杰克遜實(shí)驗(yàn)室)單劑量ISO 200(n=5)、300(n=1)、400(n=4)、500(n=1)、 600(n=1)、700(n=1)、800(n=1)和1000(n=5)mg/(kg·bw)，并對(duì)給予200、300、400、1000 mg/(kg·bw)的小鼠行心電圖檢查以探索各劑量ISO對(duì)小鼠心臟的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)400、1000 mg/kg ISO給藥的小鼠心電圖最初表現(xiàn)為心率略增加，隨后幾分鐘出現(xiàn)竇性停搏、心室傳導(dǎo)阻滯、室性逸搏心律，而終止于室性心動(dòng)過速或心臟停搏，因此推測嚙齒類動(dòng)物可耐受的ISO最高非致死劑量為300 mg/kg，故選取200及300 mg/(kg·bw)劑量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)單劑量ISO 200 mg/(kg·bw)或300 mg/(kg·bw)皮下注射后1 d，小鼠心臟收縮功能瞬時(shí)增加，舒張功能無變化，血清cTnI水平升高。通過伊文思藍(lán)染料(EBD)攝取評(píng)估表明ISO可以改變心肌細(xì)胞的膜通透性而不一定導(dǎo)致壞死。EBD + 心肌細(xì)胞存在于整個(gè)心室內(nèi)，而不僅局限于左心室心內(nèi)膜或心尖區(qū)域。然而，另一研究給予16周齡野生型C57BL/6小鼠從50 mg/(kg·bw)起始逐漸遞增的單劑量ISO，直至在單劑量ISO 400 mg/(kg·bw)后2 h小鼠中檢測到明顯的節(jié)段性心臟功能障礙，但并不導(dǎo)致小鼠直接死亡[14]。因此，300 mg/kg ISO是否為嚙齒類動(dòng)物可耐受的最高非致死劑量仍有待進(jìn)一步研究。

2 ISO誘導(dǎo)心肌損傷模型的發(fā)病機(jī)理

2.1 炎癥反應(yīng)

炎癥免疫反應(yīng)在ISO所致心肌損傷中發(fā)揮重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，ISO可以誘導(dǎo)包括TNF-α、IL-1β、IL-6在內(nèi)的多種心肌炎性因子的表達(dá)[15-16]。另外，雄性C57BL/6小鼠模型細(xì)胞因子陣列分析ISO對(duì)心肌的作用，發(fā)現(xiàn)趨化因子在心臟內(nèi)特異性上調(diào)的初始細(xì)胞因子中起主導(dǎo)作用，促進(jìn)了早期巨噬細(xì)胞的浸潤，增強(qiáng)細(xì)胞炎癥免疫反應(yīng)，間接導(dǎo)致心肌損傷增加的趨化因子包括單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、MCP-5、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1a(MIP-1α)和C-X-C趨化因子10(CXCL-10)，均在ISO處理后12 h達(dá)到最高表達(dá)水平。相比之下，升高的促炎性細(xì)胞因子(如IL-6和TNF-α)直到24 h才被檢測到，并持續(xù)到ISO給藥后72 h。相反，在此過程中未檢測到T細(xì)胞，B細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，IL-18(而非IL-1β)的快速炎癥體依賴性激活是由ISO誘導(dǎo)的β1-AR-ROS信號(hào)介導(dǎo)的，是心肌中上調(diào)趨化因子表達(dá)的關(guān)鍵上游調(diào)控因子。IL-18或上游炎性小體成分NLRP3的基因缺失使異源性趨化因子的表達(dá)和炎細(xì)胞因子、粘附分子、巨噬細(xì)胞的浸潤明顯下降，從而有效減輕心臟炎癥和纖維化。但是，炎癥反應(yīng)在ISO所致的心肌損傷的發(fā)病中作用仍有待進(jìn)一步闡明[17]。

2.2 氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化

研究表明ISO處理的成年雄性Wistar大鼠(170 ～ 200 g，n=10，來自印度新德里醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院中心畜舍設(shè)施)抗氧化酶水平顯著降低，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽等；而丙二醛水平升高[8]。ISO還能夠引起電壓敏感Ca2+通道打開和過度的Ca2+內(nèi)流，使心肌收縮增強(qiáng)，進(jìn)而增加氧需求，導(dǎo)致ATP消耗和呼吸鏈中的電子泄漏。這些釋放的自由電子與分子氧反應(yīng)形成活性氧基團(tuán)(reactive oxygen species，ROS)，進(jìn)一步氧化蛋白質(zhì)、DNA和膜脂質(zhì)等細(xì)胞組分，直接損傷心肌。此外，ROS引發(fā)TNF-α和IL-6等炎性細(xì)胞因子的釋放會(huì)導(dǎo)致肌質(zhì)網(wǎng)中Ca2+泵的持續(xù)抑制，間接對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響[18]。此外，ROS導(dǎo)致脂質(zhì)膜破壞使LDH和CK-MB等胞質(zhì)酶釋放入血液中，因此通過檢測ISO組大鼠血清中的這些胞質(zhì)酶可判斷是否存在心肌損傷[19]。

同時(shí)，ISO使心臟組織中脂質(zhì)積聚并發(fā)生脂質(zhì)過氧化從而導(dǎo)致心臟功能障礙。研究顯示ISO 85 mg/(kg·bw) 2 d導(dǎo)致雄性白化Wistar大鼠(120 g，n=8)血清總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇和脂質(zhì)過氧化的濃度顯著增加，而高密度脂蛋白膽固醇濃度顯著降低。重要的是，ISO處理后卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶、對(duì)氧磷酶和脂蛋白脂肪酶的活性顯著降低，而3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)的活性顯著增加[20]。這些表明脂毒性與兒茶酚胺引起的心肌功能障礙密切相關(guān)。

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)

ERS能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)折疊和運(yùn)輸以及細(xì)胞內(nèi)鈣濃度等不同細(xì)胞過程,參與高血壓、心肌缺血和擴(kuò)張型心肌病等多種導(dǎo)致心力衰竭的心臟疾病[21]。ISO 5 mg/(kg·bw)作用7 d誘導(dǎo)的雄性C57BL/6小鼠(6 ～ 8周，20 ～ 25 g，來自美國緬因州巴爾港杰克遜實(shí)驗(yàn)室)心力衰竭模型中，ISO能夠顯著上調(diào)心肌組織中GRP78蛋白表達(dá)，進(jìn)一步激活其下游的PERK、IRE1和eIf2a來啟動(dòng)ERS[22]。在ISO所致的雄性Wistar大鼠(200 ～ 250 g，n=20，來自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)心肌損傷模型中，ISO能夠使心肌中ER伴侶蛋白和相關(guān)凋亡蛋白明顯增加；應(yīng)用鈣受體(calcium receptor，CaR)激活劑calindol后ER伴侶蛋白的表達(dá)和凋亡率有所增加，而應(yīng)用CaR阻斷劑calhex231后上述蛋白的表達(dá)降低。ISO處理48 h后，CaR活化使肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+濃度降低、線粒體內(nèi)Ca2+濃度升高，從而降低線粒體膜電位，使ER應(yīng)激伴侶蛋白及相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，表明鈣敏感受體通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在ISO所致心肌損傷發(fā)揮著重要的作用[23]。同時(shí),另一研究表明ISO抑制AMPK活化并增強(qiáng)ERS，隨后導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[24]。

2.4 自噬

自噬是依賴溶酶體途徑對(duì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器進(jìn)行降解的一種過程，，參與細(xì)胞更新和穩(wěn)態(tài)的維持。自噬在許多疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病、炎癥反應(yīng)和其他心肌病[25]。自噬依賴性心肌細(xì)胞死亡已在心肌梗塞動(dòng)物模型中得到證實(shí)，然而卻很少有研究報(bào)道自噬是否可以影響心臟成纖維細(xì)胞活化。因此，Dong等[26]假設(shè)自噬可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞在增殖和分化中的激活，使用Toll樣受體4敲除(TLR4 KO)小鼠作為自噬不足的陰性對(duì)照。結(jié)果表明TLR4 KO減輕ISO誘導(dǎo)的心臟纖維化，該效應(yīng)可能與抑制自噬有關(guān)。因此，推測適度抑制自噬活性可能是治療心臟纖維化的新策略。相反，Lu等[27]卻發(fā)現(xiàn)ISO誘導(dǎo)原代新生大鼠心肌細(xì)胞(NRCMs)發(fā)生肥大反應(yīng)并抑制該細(xì)胞自噬活性，而SIRT6誘導(dǎo)的自噬可能通過抑制Akt信號(hào)傳導(dǎo)來減輕ISO誘導(dǎo)的心臟肥大，并推測促進(jìn)自噬可能成為治療心臟肥大的有效方法。自噬在心肌損傷中的作用猶如一把雙刃劍，被生物體微妙地調(diào)控著。

2.5 凋亡

Fas配體(FasL)及其受體Fas(CD95/APO-1)均參與細(xì)胞死亡調(diào)控，被認(rèn)為是心肌梗死、缺血再灌注(I-R)損傷和慢性心力衰竭等多種心臟病理的重要因素[28]。有證據(jù)表明細(xì)胞外基質(zhì)蛋白CCN1/Cyr61能夠促進(jìn)FasL和TNF家族細(xì)胞因子的細(xì)胞毒性。在ISO誘導(dǎo)的心肌損傷模型中，CCN1通過增加ROS和細(xì)胞表面Fas的表達(dá)提高細(xì)胞對(duì)fas所誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性，使心肌細(xì)胞更容易受到應(yīng)激性心臟的死亡刺激，提示阻斷CCN1可能減輕小鼠心肌損傷[29]。

ISO 通過炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬和凋亡等機(jī)制直接和間接地誘導(dǎo)形成心肌損傷動(dòng)物模型。這些機(jī)制并不是獨(dú)立存在的，而是通過各種方式相互聯(lián)系、相互影響的。關(guān)于ISO建立實(shí)驗(yàn)性心肌損傷模型的機(jī)制仍存在許多未知，有待進(jìn)一步研究。

3 展望

ISO通過炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬和凋亡等機(jī)制直接和間接地引起心肌損傷。這些機(jī)制并不是獨(dú)立存在的，而是通過各種方式相互聯(lián)系、相互影響的。ISO建立的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，包括病理性心肌損傷、心肌梗死、心肌肥厚和心力衰竭等，有助于我們深入理解β-腎上腺素能受體刺激下發(fā)生的病理變化和病理機(jī)制并找到治療交感神經(jīng)過度活化的最佳途徑。在大鼠心臟中由單次、兩次或多次過量ISO引起的急性心肌梗塞癥狀與人類相似，因此使用ISO模型作為合并HF的非侵入性AMI模型尤為適用。同時(shí)，對(duì)該動(dòng)物模型的體外和體內(nèi)觀察為β-腎上腺素能受體過度刺激引起左室重塑和心力衰竭患者的治療提供了合理機(jī)制。最近有研究表明ISO所致心肌損傷可能還與E2/ER β受體等有關(guān)[30]。由此可見，ISO誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性心肌損傷模型仍有待進(jìn)一步研究，其在心血管疾病診療方面具有重要意義和廣闊前景。

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