陳 鋒，吳鄒平，郭菁菁，呂婧薇，鄭宇彬，楊為祝，王思宇，李長(zhǎng)征

(福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建福州350122)

鑄型透明標(biāo)本是往血管內(nèi)注入某種物質(zhì)，待硬化后將組織用物理和化學(xué)的方法使軟組織和透明劑的折光率相近，達(dá)到軟組織透明，使骨骼和鑄型枝被顯現(xiàn)[1]。此技術(shù)的運(yùn)用可以為兩棲類(lèi)動(dòng)物血液循環(huán)的標(biāo)本制作提供直觀的全身血管形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，對(duì)兩棲類(lèi)動(dòng)物血液循環(huán)研究提供新的模型；對(duì)了解牛蛙全身血管和骨骼器官的分布情況，改進(jìn)醫(yī)學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)方法具有促進(jìn)作用；在動(dòng)物標(biāo)本制作方面為鼠、蛇和魚(yú)等其他小型動(dòng)物鑄型透明標(biāo)本的制作提供新的思路；在標(biāo)本應(yīng)用方面為科研人員對(duì)于動(dòng)物學(xué)的器官、骨骼和血管研究、比較解剖學(xué)的研究提供直觀的形態(tài)學(xué)依據(jù)。目前關(guān)于骨骼透明血管鑄型已有報(bào)道，但是基本多見(jiàn)于某個(gè)器官，小型動(dòng)物全身標(biāo)本制作較少，難度較高[2-4]。本方法使用不同的透明方式，調(diào)整了填充劑濃度，提高了成功率，制作出的標(biāo)本效果良好，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 來(lái)自福建地區(qū)健康成年的牛蛙10只，體重(0.25±0.05)kg，不分雌雄。15%過(guò)氯乙烯填充劑、無(wú)水乙醇、10%甲醛、尿素透明液(尿素240 g、10%甘油1 000 mL、Triton X-100 10 mL)、茜素紅、過(guò)氧化氫溶液、任氏液、20 mL塑料注射器、玻璃插管、止血鉗、持針器、鑷子、組織剪、燒杯、玻璃棒、量筒、玻璃缸若干等。

1.2 試驗(yàn)方法 用鑷子夾取一浸透無(wú)水酒精的棉球,塞入牛蛙口腔中,待牛蛙全身肌肉松弛，眼瞼角膜反射消失；打開(kāi)胸腹腔，剪開(kāi)下腔靜脈放血，再打開(kāi)心包，暴露心臟，剪開(kāi)心室，在動(dòng)脈干分叉處前插管結(jié)扎，然后用任氏液進(jìn)行沖洗殘余血液與凝塊；將注射器上端連接在玻璃插管上，用力抽取直至不能抽動(dòng)為止，然后用止血鉗夾住橡膠插管，以防空氣進(jìn)入管道里面；向其注入配制好的15%過(guò)氯乙烯填充劑，見(jiàn)四肢末端有填充劑則停止灌注，每隔1～2 h補(bǔ)注1次，1～3次即可。

去除牛蛙皮膚，將其放入配好的10%甲醛固定(標(biāo)本體積5～10倍)，固定1周左右；固定后的標(biāo)本用流水沖洗5 h,過(guò)氧化氫漂白6～12 h(中途需更換)，清水沖洗6 h去除殘余過(guò)氧化氫，將標(biāo)本依次浸泡在配置好的80%、90%、100%酒精溶液中脫水各1周左右。

標(biāo)本放入尿素透明液中，半個(gè)月左右，見(jiàn)肌肉呈半透明狀態(tài)，骨骼隱約可見(jiàn)，即停止初步透明；預(yù)透明結(jié)束后，將標(biāo)本浸入0.01%茜素紅染液中2～3 d，見(jiàn)骨骼染上紫紅色為止；用水洗去表面浮色，將標(biāo)本浸入50%甘油溶液中，直到肌肉顏色褪為淡紅色為止，之后分別放入60%、70%、80%、90%甘油中各1周，待充分透明后浸入純甘油中保存。

2 結(jié)果

制作出的牛蛙標(biāo)本肌肉和軟組織呈淡黃色膠凍狀，全身血管清晰可見(jiàn)，骨骼完整且呈玫瑰紅色。所顯示的牛蛙頭骨、四肢骨和脊柱骨顏色清晰均勻，易于識(shí)別(見(jiàn)中插彩版圖1)；牛蛙頭部、脊柱區(qū)肩胛骨和四肢骨的血管(見(jiàn)中插彩版圖1和2)以及腹腔內(nèi)胃、腸的血管(見(jiàn)中插彩版圖3)清晰可見(jiàn)；從整體上能充分顯現(xiàn)骨骼系統(tǒng)和脈管系統(tǒng)在體內(nèi)的自然分布情況及毗鄰關(guān)系。

3 討論

試驗(yàn)的注意事項(xiàng)：首先，本試驗(yàn)中所選的牛蛙需滿(mǎn)足發(fā)育成熟、大小適中，太小不利于血管鑄型，太大不利于后期骨骼染色透明；其次，試驗(yàn)過(guò)程中，牛蛙在失去生命體征后半個(gè)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行灌注最佳，若放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，易凝血，導(dǎo)致細(xì)小血管堵塞，影響灌注及透明效果；再次，灌注前需充分排血，用任氏液進(jìn)行沖洗，可以保證蛙心的持續(xù)跳動(dòng)；從次，血管灌注過(guò)程中，用力要均勻緩慢，若力度過(guò)大，管道內(nèi)壓力過(guò)大，易導(dǎo)致主動(dòng)脈弓破裂使灌注失敗，因此需仔細(xì)感受壓力并時(shí)刻觀察牛蛙四肢及背部細(xì)小血管的灌注程度；最后，透明過(guò)程中需時(shí)刻保持警惕，否則將導(dǎo)致整個(gè)試驗(yàn)失敗，如漂白時(shí)要注意觀察標(biāo)本的漂白程度，見(jiàn)肌肉上顏色基本脫掉即可，太過(guò)容易使細(xì)小鑄型枝褪色，肌肉間產(chǎn)生大量氣泡等問(wèn)題。

試驗(yàn)的改進(jìn)創(chuàng)新：在透明劑的選擇上 以往的研究多選擇二甲苯和氫氧化鉀為透明劑，其中二甲苯透明效果顯著，但存在使組織收縮、變脆和硬化，影響透明效果等問(wèn)題[5]，且二甲苯是一種強(qiáng)致癌物，對(duì)試驗(yàn)者生命健康有潛在的威脅，氣體揮發(fā)到空氣中會(huì)對(duì)周?chē)h(huán)境造成污染；氫氧化鉀雖無(wú)毒無(wú)害，但在透明的時(shí)間和濃度上很難把握，很容易造成標(biāo)本的損壞且透明效果不穩(wěn)定；本試驗(yàn)選擇無(wú)毒并具有一定溶解蛋白質(zhì)作用的尿素和細(xì)胞破膜劑Triton X-100[6]，兩者對(duì)組織的作用使甘油更易滲透，從而提高組織的透明度，透明后的組織呈膠凍狀，標(biāo)本形態(tài)完整，利于保存，且透明效果穩(wěn)定可靠，能極大提高透明標(biāo)本的成功率。

在填充劑濃度的選擇上,選擇過(guò)氯乙烯溶劑作為填充劑，其原理為溶劑揮發(fā)后凝固成型，此類(lèi)填充劑收縮率大,流動(dòng)性好,適合灌注流程較長(zhǎng)的微細(xì)血管。以往的研究多集中于哺乳動(dòng)物的血管灌注，多采用20%～25%過(guò)氯乙烯填充劑，以充分保證鑄型枝的飽滿(mǎn)。而牛蛙血管微細(xì)，其管徑、彈性和厚度都不如哺乳動(dòng)物。因此，填充劑的濃度應(yīng)小于20%，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，選用濃度為15%過(guò)氯乙烯填充劑最為適宜。在該濃度下，灌注不會(huì)因管內(nèi)壓力過(guò)大而導(dǎo)致填充劑無(wú)法到達(dá)末端血管；也不會(huì)因填充劑濃度過(guò)低，揮發(fā)性過(guò)高，鑄型支無(wú)法完好顯現(xiàn)。

在試驗(yàn)對(duì)象的選擇上 由于哺乳動(dòng)物的體型相對(duì)較大，血管較粗、彈性較好、易于灌注，所以傳統(tǒng)上制作鑄型標(biāo)本時(shí)多采用哺乳動(dòng)物作試驗(yàn)對(duì)象，然而全身血管鑄型及骨骼透明標(biāo)本制作的報(bào)道僅見(jiàn)于胎兒，因哺乳動(dòng)物胎兒期標(biāo)本的不易獲取，使其成為此類(lèi)標(biāo)本制作鮮有報(bào)道的一個(gè)關(guān)鍵原因。而本次研究另辟蹊徑，選擇材料易找，難度大、技術(shù)要求高、成功率低的兩棲類(lèi)動(dòng)物-牛蛙作為對(duì)象，因其在全國(guó)各地的醫(yī)學(xué)院和動(dòng)物科學(xué)院的動(dòng)物試驗(yàn)中應(yīng)用廣泛，有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

牛蛙全身動(dòng)脈血管鑄型透明標(biāo)本的意義：(1)教學(xué)和科研方面 牛蛙作為兩棲恒溫動(dòng)物，與人體在一定程度上有所相似，因而在眾多生物試驗(yàn)上被選作試驗(yàn)對(duì)象，然而在教學(xué)過(guò)程中，學(xué)生僅通過(guò)課堂講解和教學(xué)視頻來(lái)熟悉操作流程且無(wú)法直觀的了解牛蛙的解剖學(xué)構(gòu)造及重要臟器,在試驗(yàn)過(guò)程中的盲目操作，導(dǎo)致判斷不出相應(yīng)的解剖部位，極易傷及血管，致使試驗(yàn)失敗，從而達(dá)不到試驗(yàn)預(yù)期效果。目前已有的教學(xué)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本-浸制標(biāo)本、骨骼標(biāo)本和剝制標(biāo)本等都存在著一定的不足，它們不但破壞了牛蛙的外形，而且不能很好的展示牛蛙血管和骨骼的位置關(guān)系。利用牛蛙全身動(dòng)脈血管鑄型透明標(biāo)本，可以多維度的觀察血管的形態(tài)、走行以及血管與周?chē)∪狻⒐趋篮推鞴俚年P(guān)系。在教學(xué)過(guò)程中，可以通過(guò)對(duì)標(biāo)本的觀察，讓學(xué)生有直觀立體的感性認(rèn)識(shí)，加深對(duì)牛蛙內(nèi)部器官結(jié)構(gòu)的印象，提高教學(xué)試驗(yàn)的成功率，減少試驗(yàn)的耗材。通過(guò)該標(biāo)本的制作也可以為科研人員對(duì)于動(dòng)物學(xué)的器官、骨骼和血管研究、比較解剖學(xué)的研究、兩棲動(dòng)物生理、生態(tài)的研究提供直觀的形態(tài)學(xué)依據(jù)。(2)養(yǎng)殖方面 隨著牛蛙養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，各種疾病問(wèn)題相繼出現(xiàn)，對(duì)牛蛙養(yǎng)殖技術(shù)中疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提出了更高的要求。牛蛙全身血管鑄型透明標(biāo)本在牛蛙解剖的診斷治療中發(fā)揮了重要的指導(dǎo)作用。