不同種屬移植性肝癌動物模型的研究及建模策略

陳 思，黃小青，陳秀娟，楊 春，唐艷萍，李科志，曹 驥

(1.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，廣西南寧530021；2.廣西醫(yī)科大學研究生學院，廣西南寧530021；3.區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室，廣西南寧530021)

肝癌(Liver cancer)通常是指發(fā)生于肝臟的癌癥，如果由于肝臟內(nèi)細胞所引發(fā)的癌癥，稱之為原發(fā)性肝癌，而由身體其他器官癌細胞轉(zhuǎn)移至肝臟而形成的惡性腫瘤，稱為繼發(fā)性肝癌。原發(fā)性肝癌中85%屬于肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)。作為死亡率較高的惡性腫瘤之一，其特點是進展迅速，治療后易復發(fā)轉(zhuǎn)移，據(jù)相關(guān)資料顯示，近20年病死率呈逐年上升趨勢。全球每年發(fā)病人數(shù)在60萬以上，中國肝癌的發(fā)病率占全球50%以上[1-3]，據(jù)2017年美國癌癥協(xié)會發(fā)表的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，近25年美國癌癥總死亡率降低了25%，但肝癌的死亡率仍保持上升趨勢[4]，研究病因及有效的治療措施迫在眉睫。然而到目前為止，HCC的致病機理、促癌致癌因素尚未明確，治療及抑制轉(zhuǎn)移效果尚不理想。動物模型是研究發(fā)病機制及臨床藥物試驗的重要載體[5]，因此，建立接近與人體肝癌臨床特征的動物模型對于明確病因及發(fā)病機制，發(fā)掘新的治療方法具有重要意義。當前肝癌模型主要采用的動物包括小鼠、大鼠、裸鼠、倉鼠、兔、豬、魚等，腫瘤的成因主要包括自發(fā)性、誘發(fā)性和移植性，本文主要探討移植性肝癌模型。

1 肝癌模型的研究進展及應用

自發(fā)性肝癌是指實驗動物未經(jīng)人為因素干預，在完全自然狀態(tài)下形成腫瘤組織；誘發(fā)性肝癌是通過化學、物理、生物等因素有目的作用于動物機體，通過損傷-纖維化-惡性轉(zhuǎn)化過程引發(fā)癌腫[6]。以上兩種肝癌模型均具有誘發(fā)周期長、起病具隱匿性、荷瘤動物個體差異大等特點，自發(fā)性肝癌模型的制備耗時長、成功率低，一般很少采用[7]，誘發(fā)性肝癌因為采用化學制劑致癌，具有一定的可控性，常用于病因機制、遺傳學方面的研究，移植性肝癌是將來源于人或者動物的肝癌組織、細胞株或其他類型的惡性腫瘤移植入目的動物體內(nèi)，彌補了腫瘤位置和大小的差異性不足，且移植存活率高，瘤體生長速度快，不僅可供于肝癌病因?qū)W的探索還可用于轉(zhuǎn)移性機制及抑癌性的研究、抗癌藥的篩選。

通過檢索中國期刊全文數(shù)據(jù)庫(表1)，自2016年1月至2017年9月共收錄有關(guān)肝癌動物模型實驗264例，其中采用誘發(fā)性動物模型50例，移植性214例。當前國內(nèi)應用肝癌動物模型主要集中在新藥的抗癌篩選、藥效研究方面，占各類研究內(nèi)容的74.0%，其次是動物模型構(gòu)建方面的研究占比11.70%，采用小鼠作為肝癌模型的最多，比例為52.65%。

在種屬的選擇上主要依據(jù)試驗的研究內(nèi)容：小鼠、裸鼠和家兔主要是采用移植瘤株來構(gòu)建模型。小鼠和裸鼠主要是異位移植，以腋窩和背部皮下為主，采用的瘤株多為H22小鼠肝癌細胞和HepG2人肝癌細胞。一般用來進行藥物試驗，特點是建?？旖?、觀察方便；家兔因為個體較其他模型偏大，容易通過外科手術(shù)直接將瘤株種植于肝臟，進行放射性治療和影像學研究更有優(yōu)勢，主要采用VX2瘤株；大鼠和斑馬魚主要用于肝癌病因?qū)W的研究，以化學物質(zhì)誘發(fā)肝細胞癌，大鼠常用Wistar、SD鼠研究致病機理，誘導劑一般采用二乙基亞硝胺(DEN)、黃曲霉素(AFB1)、四氯化碳(CCl4)二甲基氨基偶氮苯(3＇-Me-DAB)等，斑馬魚作為生物模型始于19世紀80年代，構(gòu)建肝癌模型的優(yōu)勢在于其肝細胞功能接近于哺乳動物，如肝臟發(fā)育信號通路和相關(guān)因子、糖原和脂肪的儲存、膽汁分泌、血清蛋白分泌等，并且與人類基因有87%的同源性[8]。但與哺乳類動物模型不同，斑馬魚難以開展移植性操作，多采用誘導性和轉(zhuǎn)基因技術(shù)處理胚胎得到目的模型[9]。

表1 中國期刊全文數(shù)據(jù)庫收錄的不同種屬肝癌動物模型試驗統(tǒng)計 (2016年1月- 2017年9月)

注：部分試驗同時進行了多位點移植或者雙重目的性試驗，裸鼠、大鼠和兔組別中均有1例試驗同時移植了2個位點，裸鼠組中有2例試驗包含兩項研究內(nèi)容

2 腫瘤移植位點

移植性腫瘤模型自建立30多年來，位點從最初的皮下移植逐漸發(fā)展至腹腔移植、原位移植、血液移植、淋巴移植等；移植的類型主要包括同種和異種移植兩種[10]，當前有關(guān)肝癌動物模型移植位點的選擇主要包括以下幾種。

2.1 皮下移植 是各類模型最常用的位點，早期的移植材料來源為新鮮的人肝癌邊緣組織，成功率較低只有11%左右，后來逐漸發(fā)展為應用細胞株，在HCC研究中，將人或動物的肝癌細胞株(或組織)種植于頸背部、腋下、后肢等部位的皮下，移植成功率分別為前肢腋下>軀干近頭側(cè)>背部>后肢，其中將人肝癌細胞種植到免疫功能缺陷的小鼠頸背部皮下，當移植的腫瘤細胞數(shù)為(1～5)×106時，成功率接近100%[11]。由該癌株增殖的腫瘤基本具有人肝癌細胞的特性，所得試驗結(jié)果更有意義[12]。皮下移植不僅操作簡單、觀察測量方便，而且可以作為原位移植瘤的瘤源資源，但其缺點是缺乏肝癌細胞與肝臟組織之間的相互作用，在試驗中有部分呈假陽性，而且如研究肝癌的遠端轉(zhuǎn)移選擇該位點也不宜得到理想模型[11]。

2.2 原位移植 原位移植較皮下移植有較高的操作要求，但其優(yōu)點在于保留了原有腫瘤組織的生物學特點和微環(huán)境，能更好地反應肝癌的侵襲能力和免疫逃逸機制[13]，而且腹腔浸潤轉(zhuǎn)移和腹水等生理現(xiàn)象也多見于此模型。原位移植模型的建立一般有兩種途徑，一種是將剪好的腫瘤組織(1×1×1 mm3)通過外科手術(shù)方法(開腹、穿刺)植入肝區(qū)[14]，當前也有很多模型是通過輔助設備進行肝瘤塊的種植，例如經(jīng)皮穿刺CT、DSA、MR影像引導制作兔VX2肝癌模型[15-16]；另一種是將細胞懸液直接注入肝左葉，而且在細胞數(shù)目(1～5)×106時，較易發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移[17]。在先前的試驗研究中，原位移植瘤的缺點在于只有將模型處死后才可進行瘤體組織的取出測量[18]，但當前有了影像學設備的輔助使得在體觀察腫瘤生長、甚至新生血管變化成為可能，例如閻曉朋等[19]通過CT能譜成像及灌注成像技術(shù)對兔肝腫瘤模型中血供變化進行研究，余梁等[20]在VX2移植兔模型實施了肝癌經(jīng)動脈栓塞術(shù)(TAE)后,通過CT與DSA對腫瘤生長和新生血管進行影像學評估，獲得理想效果。

2.3 腹腔移植 腹腔移植在操作方面最為簡單，而且可出現(xiàn)一定數(shù)量的轉(zhuǎn)移、浸潤、腹水的案例，但缺點在于不便于瘤體的觀察和測量。移植方法是將人肝癌細胞株或者組織碎片注入腹腔內(nèi)，動物的前側(cè)腹壁比后側(cè)腹壁更有利于癌株的增殖，該模型的應用主要包括：(1)研究HCC侵襲周圍組織和肺、肝、腎、腸等遠端器官轉(zhuǎn)移的過程；(2)藥物篩選試驗；(3)通過腹腔移植可以傳代和培養(yǎng)，在進行原位或異位移植前，將復蘇的瘤株注入目標動物腹腔內(nèi)傳代，待傳代完成過后可得到理想數(shù)量的肝癌細胞，并且傳代后活性更高，對于體內(nèi)環(huán)境適應性更強，提高移植成功率。

2.4 靜脈移植 中國肝癌的發(fā)病易伴發(fā)多種途徑轉(zhuǎn)移[21]。肝癌細胞因自發(fā)或者診療操作進入血液循環(huán)系統(tǒng)，稱為循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)，在隨血液流動種植于某個器官便發(fā)生了肝癌的遠處轉(zhuǎn)移，返回殘肝或者肝臟組織后種植便是復發(fā)性肝癌[22]，作為一種新興的腫瘤標記物，又稱為“液體活檢”(Liquid biopsy)[23]，研究CTCS的作用機制，減少其在血液中數(shù)目，有利于改善肝癌患者的預后。據(jù)報道，免疫療法對于HCC復發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者行之有效[24]，因此研究人員需要通過多發(fā)轉(zhuǎn)移性肝癌動物模型進行試驗，CTCs模型的建立主要方式便是靜脈移植，一般是將低劑量的腫瘤細胞注入門靜脈或者脾靜脈[25-26]。羅桂芳等通過小鼠尾靜脈移植體外培養(yǎng)的Hepa 1～6 細胞，也成功的制作出了CTCs模型[27]。通過該類移植模型的建立可更好地研究肝癌的轉(zhuǎn)移機理及探索更有效的治療策略。

2.5 其他位點移植 除以上的移植位點外還有一些其他的異位轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建，如腎包膜下移植，將瘤株植入兩腎包膜下，由于腎臟血供豐富，免疫機能稍差，一般接種成功率高于皮下移植[28]，且易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，其他常見的移植位點還包括脾[29]。

3 瘤株選擇

3.1 人源性肝癌細胞株 HepG2分離于高加索地區(qū)一個15歲白人肝癌患者的肝胚細胞，該細胞系可分泌白蛋白(ALB)、巨球蛋白(a2-MG)等，由于來源的肝癌組織類型為肝母細胞瘤，因此適合用于肝細胞代謝方面的研究，低轉(zhuǎn)移，生長較快。美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)建議該細胞株在免疫抑制小鼠體內(nèi)不易致瘤，因此一般移植于免疫缺陷的裸鼠模型中[30]；SMMC-7721，取自于一例HCC患者肝臟組織，甲胎蛋白(AFP)呈陽性，裸鼠體內(nèi)移植，成瘤率高；Bel-7402，同樣為HCC屬，特點是異種移植成瘤率高，瘤塊組織學病例與HCC類似；MHCC97是由我國一名39歲HCC患者的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶標本移植入裸鼠(LCI-D20)而得，分離得到了HCCLM3、MHCC97-L、MHCC97-H 3種細胞株，HCCLM3和MHCC97-H具有高轉(zhuǎn)移潛能，MHCC97-L具低轉(zhuǎn)移潛能[31-32]；Huh-7細胞細胞源自一個日本男性高分化肝癌細胞，能產(chǎn)生一些細胞質(zhì)蛋白，如白蛋白、a抗胰蛋白酶，AFP陽性，高度分化，乙型肝炎病毒(HBV)陰性，易感丙型肝炎病毒(HCV)，廣泛用于異種移植，研究HCV與HCC間關(guān)系[33]；PLC/PRF/5稱為人肝癌亞歷山大細胞，HCC屬，可能包含全部HBV基因組，一般用來研究HBV體外病毒與HCC間關(guān)系[34]。

3.2 動物源性肝癌細胞株 H22(Hepatoma 22)肝癌細胞是小鼠的肝細胞腫瘤，是由亞氨基偶氮甲苯(OAAT)誘發(fā)通過皮下傳代的實體瘤，1963年引入我國并作為腹水瘤(Hca、HAC、Hepa)長期保存[35]；Hca-F是從腹水型H22細胞株中篩選出來的特異性向淋巴道轉(zhuǎn)移的小鼠肝癌細胞，一般多用來轉(zhuǎn)移性肝癌模型的構(gòu)建；Hepa 1-6，鼠肝癌細胞，體外培養(yǎng)形態(tài)特征上皮樣貼壁生長，來自C57/L小鼠中引發(fā)的BW7756肝癌，AFP陽性、產(chǎn)生α1抗胰蛋白酶、淀粉酶；S-180小鼠肉瘤細胞，一般先經(jīng)腹腔傳代培養(yǎng)再進行細胞移植。Walker-256肝癌細胞是將大鼠乳腺癌細胞接種到肝臟成瘤保種傳代制作，多移植于Wistar或SD大鼠，一般應用于腫瘤學基礎(chǔ)研究和細胞傳代[36]，因為其能較好的模擬腫瘤的浸潤發(fā)展和膨脹式生長，被廣泛認可[37]。兔VX2細胞系于1940年建株保存，來源于兔鱗狀上皮細胞癌，該癌株在兔同種腋窩下移植成瘤率接近100%，其顯著特點是在侵襲時，多種基質(zhì)金屬蛋白高表達，是一種優(yōu)良的轉(zhuǎn)移模型[38]。

4 不同種屬肝癌移植模型的建立策略

4.1 小鼠移植模型 采用品系主要包括：BALB/c小鼠、昆明種小鼠(KM小鼠)。

4.1.1 皮下移植模型：復蘇H22肝癌細胞，離心、稀釋，調(diào)節(jié)細胞至2×106個/mL，注射入小鼠腹腔內(nèi)，傳代培養(yǎng)，取第2代后腹水，稀釋細胞至1×107個/mL，用注射器抽取0.2 mL細胞懸液，接種到小鼠的右腋窩皮下成瘤[39]。

4.1.2 原位移植模型 原位移植的前期培養(yǎng)和傳代與皮下移植模型相同，獲得細胞懸液后備用。移植模型術(shù)前禁食10 h、禁水4 h，可用4%水合氯醛或者2%戊巴比妥進行麻醉，仰臥保定，常規(guī)剪毛、消毒，于上腹劍突下逐層剪開1 cm切口，輕壓兩側(cè)肋弓，小鼠肝左葉暴露，以與肝平面20 °進針0.5 cm左右，注入0.05 mL懸液，輕壓針眼5 min以上，為防止漏液也可用燒紅的鐵絲封閉針眼，確定穩(wěn)定后，還納腹腔，逐層縫合，消毒術(shù)閉[40]。

4.2 裸鼠移植模型 裸小鼠(Nude mice)是一種先天無毛小鼠，最早由Flanagan于1966年發(fā)現(xiàn)，之后于1969年被Rygaard和Pocvlsen通過實驗證實其胸腺先天發(fā)育不良[41]，免疫功能缺陷，缺少T細胞，因此在移植方面成功率更高，自1976年Shimosato首次建立了裸鼠人癌移植模型后[42]，國內(nèi)外學者先后建立了裸鼠皮下、原位、腹腔等移植模型均獲成功[43]。但該類模型具有一定局限性：據(jù)研究表明，針對HCC患者，采用基因生物免疫療法有可能成為治療的最佳方案之一，但裸小鼠由于自身免疫機能缺陷，不適用于此類模型的構(gòu)建[11]。當前品系主要選擇BALB/c裸小鼠。性別選擇方面有研究報道：人肝癌細胞HepG2接種于雄性和雌性裸小鼠右側(cè)肩部皮下后，雄性移植瘤增長速度快于雌性鼠，考慮可能是雌性鼠體內(nèi)的雌激素發(fā)揮了抑癌作用，所以在移植試驗中一般選擇雄性裸鼠[44]。裸鼠移植HepG2模型的建立一般先將細胞株體外培養(yǎng)傳代，然后進行移植，可以采用新鮮的瘤塊組織或者濃縮的瘤細胞，原位和異位移植的操作方法同小鼠模型。

4.3 大鼠移植模型 由表1可見，大鼠一般采用誘發(fā)性致癌以研究原發(fā)性肝癌的致病機理。用于移植的大鼠品系一般采用Wistar大鼠、SD大鼠或者Lewis大鼠，瘤株為Walker-256，移植位點一般為原位移植。一種方法是瘤塊嵌插法：先將濃度為1×107個/mL細胞的Walker-256瘤株1 mL注入頸部皮下，待皮下移植瘤長至1 cm時，麻醉取出，在Hank′s液中切成1 mm3碎塊，取其中1塊，在40 min內(nèi)經(jīng)劍突下腹部開腹，植入肝葉實質(zhì)內(nèi)，壓迫止血關(guān)腹，據(jù)報道移植成功率可達100%[45]；另外一種方法為直接注射法，Walker-256瘤株經(jīng)常規(guī)復蘇后經(jīng)腹腔傳代培養(yǎng)，抽取癌性腹水5 mL，清洗、離心后取下層稀糊狀液體，調(diào)整濃度為3×106個/mL的細胞懸液備用，大鼠禁食12 h，以2%戊巴比妥40 mg/kg·bw腹腔注射麻醉，仰臥位保定、剪毛、消毒，無菌條件下沿劍突下剪開腹壁2 cm，輕壓胸腔暴露肝臟，術(shù)者左手食指、中指輕夾肝葉，拇指按壓邊緣以減少肝葉隨呼吸的上下運動，針頭于肝臟成30 °刺入肝臟約0.5 cm，注入0.05 mL懸液，按壓后還納腹腔，逐層關(guān)閉[46]。

4.4 家兔移植模型 以傳統(tǒng)應用最多的通過外科手術(shù)建立VX2家兔移植模型為例：一般采用耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉(1%，3 mL/kg·bw)，麻醉后以仰臥狀態(tài)保定，于劍突下腹部剪毛，裸露表皮消毒，逐層沿中央縱行切開腹壁3 cm，牽拉肝左葉使之暴露，緩慢注入濃度為1×107個/mL的VX2細胞懸浮液1 mL，無菌紗布按壓至無細胞懸浮液外流后還納肝臟，逐層關(guān)閉縫合，術(shù)后7 d連續(xù)于耳緣靜脈注射頭孢曲松鈉20 mg/kg·bw·d預防感染[29]。隨著影像學的發(fā)展和應用，借助經(jīng)皮肝穿刺膽道造影(PTC)、MR、CT等技術(shù)引導，一方面制作肝臟家兔模型更為精確便捷；另一方面還可在手術(shù)難以操作的位點移植[16,19]。