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      人參浸出液對(duì)鉛暴露鯉魚(yú)卵巢細(xì)胞減毒作用研究

      2019-11-11 06:32:44尹玉偉尹玉林馬世宏茆安婷秦亞寧李月紅
      中國(guó)獸醫(yī)雜志 2019年6期
      關(guān)鍵詞:人參氧化應(yīng)激機(jī)體

      尹玉偉,尹玉林,馬世宏,茆安婷,秦亞寧,代 靜,李月紅

      (1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130118;2.內(nèi)蒙古烏蘭察布市獸醫(yī)監(jiān)察所,內(nèi)蒙古烏蘭察布012000;3.河南科技大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,河南洛陽(yáng)471003)

      鉛是一種生物機(jī)體非必須的重金屬,其能破壞機(jī)體正常生理功能、免疫功能、神經(jīng)功能。隨著工業(yè)的發(fā)展,造成鉛廣泛存在于大氣、水體以及土壤。重金屬中,鉛的毒性最強(qiáng)[1],并且鉛對(duì)生物的毒性不存在最小毒性劑量,因此鉛只要存在機(jī)體便有毒[2]。通過(guò)食物鏈對(duì)鉛的富集作用,使人較容易攝入高濃度鉛[3]。

      人參作為“東北三寶”之一,是一種藥食兩用植物。它能夠提高機(jī)體抗氧化能力、免疫力,此外還具有抗癌作用,起主要調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)是人參皂苷和人參多糖[4]。鉛作為一種重金屬,其能夠造成機(jī)體氧化應(yīng)激,刺激金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)[5],而人參對(duì)動(dòng)物重金屬減毒作用研究較少,本試驗(yàn)通過(guò)萃取的方式的保護(hù)人參皂苷和人參多糖,將Rs添加入GCO細(xì)胞培養(yǎng)基中,來(lái)探究其對(duì)鉛暴露細(xì)胞后的減毒作用,為后續(xù)Rs在生產(chǎn)中的使用打下理論基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)材料和試劑 GCO細(xì)胞,購(gòu)自天津水產(chǎn)研究所;胎牛血清(FBS)和M199培養(yǎng)基,購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;人參粉,吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院饋贈(zèng);醋酸鉛,購(gòu)自北京化工廠;超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒,均購(gòu)自南京建成生物工程公司;TRIZol,購(gòu)自大連TaKaRa;FastStart Universal SYBR Green Master購(gòu)自,Roche公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒,購(gòu)自江蘇愚公科技有限公司。

      1.2 試驗(yàn)方法

      1.2.1 醋酸鉛的配制和人參浸出液的制備 鉛溶液母液:3.7934 g三水合醋酸鉛。溶于10 mL雙蒸水中,配成0.01 mol/L的母液,梯度稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)。人參浸出液(Rs)的制備:人參粉加水萃取,萃取之后用蒸發(fā)皿蒸發(fā)成晶體,取10~15 g晶體溶于5 mL ddH2O,使之飽和,獲得人參浸出飽和溶液,使用0.22 μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾,按試驗(yàn)濃度加入培養(yǎng)基。

      1.2.2 GCO細(xì)胞培養(yǎng) GCO細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后,在含有10%FBS的M199完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)(含有1×106IU/mL 青霉素和鏈霉素),每天進(jìn)行觀察并進(jìn)行換液,在細(xì)胞貼壁達(dá)到90%以后進(jìn)行傳代,培養(yǎng)3~4代后進(jìn)行試驗(yàn)。

      1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

      1.2.3.1 Pb對(duì)GCO細(xì)胞活性的影響 細(xì)胞復(fù)蘇后,生長(zhǎng)至70%~80%時(shí),用1 g/L胰蛋白酶消化制備細(xì)胞懸液,以2.6×104個(gè)/孔,接于96孔板,置于27 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為對(duì)照組、0.001 mmol/L Pb組、0.005 mmol/L Pb組、0.01 mmol/L Pb組、0.05 mmol/L Pb組,加入不含血清的M199培養(yǎng)基,分別處理1 h和2 h后檢測(cè)細(xì)胞活性。

      1.2.3.2 Rs對(duì)GCO活性影響 細(xì)胞處理同1.2.3.1。將細(xì)胞分為對(duì)照組、2% Rs組、4% Rs組、6% Rs組、8% Rs組,將細(xì)胞用PBS洗3次,之后加入不同濃度Rs的M199培養(yǎng)基,處理后的12 h、24 h測(cè)定細(xì)胞活性。

      1.2.3.3 Pb和Rs對(duì)GCO活性影響 細(xì)胞處理同上1.2.3.1。將細(xì)胞分為對(duì)照組(CK)、0.01 mmol/L Pb組(Pb)、0.01 mmol/L Pb加2%Rs組(2%Rs)、0.01 mmol/L Pb加4%Rs組(4%Rs)、0.01 mmol/L Pb加6%Rs組(6%Rs)、0.01 mmol/L Pb加8%Rs組(8%Rs),所有Pb添加組,Pb處理的時(shí)間為1 h, Pb處理結(jié)束后添加不同劑量含Rs的M199培養(yǎng)基進(jìn)行處理,在Rs處理后在12 h、24 h、48 h測(cè)定細(xì)胞活性。

      1.2.4 細(xì)胞抗氧化功能測(cè)定 試驗(yàn)分組與處理同1.2.3.3。在48 h,對(duì)細(xì)胞的氧化能力進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定抗氧化SOD、GSH-Px、CAT指標(biāo)。

      1.2.5 細(xì)胞基因表達(dá)水平 (1)將細(xì)胞接于6孔板后,處理同1.2.3.3。48 h后進(jìn)行RNA提取,TRIZol法進(jìn)行提取,總RNA提取之后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,cDNA于-80 ℃保存。(2)以β-actin為內(nèi)參基因,引物信息(見(jiàn)表1)。反應(yīng)體系20 μL,包括10 μL 2×FastStart Universal SYBR Green Master,上下游引物0.6 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件94 ℃10 min、之后40個(gè)循環(huán),94 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s。計(jì)算表達(dá)量用2-△△Ct。

      表1 引物序列信息

      1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司);熒光定量PCR儀(ABI公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo scientific公司)。

      2 結(jié)果

      2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

      2.1.1 Pb對(duì)GCO細(xì)胞活性的影響 隨著Pb濃度和暴露時(shí)間的增加,相對(duì)細(xì)胞活性逐漸降低。Pb濃度分別為0.001、0.005、0.01、0.05 mmol/L暴露時(shí)間為1 h時(shí),細(xì)胞活性分別降低到86%,80%、74%和63.5%;以相同的濃度暴露2 h時(shí),細(xì)胞活性分別降低到75%,71%、61.2%和51.3%。Pb對(duì)GCO細(xì)胞活性的影響(見(jiàn)圖1A)。

      2.1.2 Rs對(duì)GCO細(xì)胞活性影響 隨著Rs濃度和暴露時(shí)間的增加,相對(duì)細(xì)胞活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。Rs添加量分別為2%、4%、6%和8%暴露時(shí)間為12 h時(shí),細(xì)胞活性分別提高到107.8%,116.2%、111%和102.8%;以相同的濃度暴露24 h時(shí),細(xì)胞活性分別提高到108.6%,120.5%、111.5%和104.3%。Rs對(duì)GCO細(xì)胞活性的影響(見(jiàn)圖1B)。

      2.1.3 Pb和Rs對(duì)GCO活性的影響 在所有處理時(shí)間點(diǎn),4%Rs添加時(shí)細(xì)胞活性顯著(P< 0.05)高于Pb、2%RS組、6%Rs組和8%Rs組。Pb和Rs對(duì)GCO細(xì)胞活性的影響(見(jiàn)圖2)。

      圖1 Pb或Rs對(duì)GCO細(xì)胞活性的影響

      A:不同劑量Pb對(duì)GCO活性的影響;B:不同劑量Rs對(duì)GCO活性的影響

      圖2 Pb和Rs對(duì)GCO細(xì)胞活性的影響

      注:圖中標(biāo)有不同字母者表示差異顯著(P< 0.05),標(biāo)有相同字母的表示差異不顯著(P> 0.05),下圖同

      2.2 細(xì)胞抗氧化測(cè)定

      2.2.1 Pb和Rs對(duì)GCO細(xì)胞SOD活性的影響 對(duì)照組顯著高于(P< 0.05)試驗(yàn)組;4%Rs組SOD顯著高于(P< 0.05)Pb組、2%Rs組、6%Rs組和8%Rs組;2%Rs組和6%Rs組SOD顯著高于(P< 0.05)Pb組和8%Rs組。Pb和Rs對(duì)GCO細(xì)胞SOD活性的影響(見(jiàn)圖3)。

      圖3 Pb和Rs對(duì)GCO細(xì)胞SOD活性的影響

      2.2.2 Pb和Rs對(duì)GCO細(xì)胞CAT活性的影響 對(duì)照組顯著(P<0.05)低于實(shí)驗(yàn)組;4%Rs組CAT顯著低于(P<0.05)Pb組、6%Rs組和8%Rs組;2%Rs組和6%Rs組顯著高于(P< 0.05)Pb組和8%Rs組;Pb組顯著高于(P<0.05)2%Rs組、4%Rs組、6%Rs組和8%Rs組。Pb和Rs對(duì)GCO細(xì)胞CAT活性的影響(見(jiàn)圖4)。

      圖4 Pb和Rs對(duì)GCO細(xì)胞CAT活性的影響

      2.2.3 Pb和Rs對(duì)GCO細(xì)胞GSH-Px活性的影響 對(duì)照組顯著(P<0.05)高于實(shí)驗(yàn)組;4%Rs組GSH-Px顯著高于(P<0.05)Pb組、2%Rs組、6%Rs組和8%Rs組;2%Rs組顯著高于(P<0.05)Pb組和8%Rs組;Pb組顯著高于(P<0.05)2%Rs組、4%Rs組、 6%Rs組和8%Rs組。Pb和Rs對(duì)GCO細(xì)胞GSH-Px活性的影響(見(jiàn)圖5)。

      圖5 Pb和Rs對(duì)GCO細(xì)胞GSH-Px活性的影響

      2.3 MT基因相對(duì)表達(dá)量 相對(duì)于對(duì)照組,各組(Pb組、2%Rs組、4%Rs組、6%Rs組、8%Rs組)MT基因表達(dá)量分別提高4.2、2.55、1.97、2.58和2.57倍。MT基因的表達(dá)量(見(jiàn)圖6)。

      圖6 Pb和Rs對(duì)GCO細(xì)胞MT基因表達(dá)量的影響

      3 討論

      研究表明,重金屬等進(jìn)入機(jī)體后會(huì)增加體內(nèi)氧化應(yīng)激,造成氧化壓力增加[6]。鉛也在很早就被發(fā)現(xiàn),會(huì)增加機(jī)體的氧化應(yīng)激[7]。氧化作用是機(jī)體必需的生物代謝,其代謝過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)較多的副產(chǎn)物(主要是活性氧;ROS),這些副產(chǎn)物如不能及時(shí)清除,就會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷[8]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn),三丁基錫暴露斑馬魚(yú)后,SOD隨著三丁基錫的暴露濃度增加呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性降低[9]。Nrf2基因是主要調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的基因,研究表明重金屬能夠抑制Nrf2表達(dá),使機(jī)體不能夠及移除過(guò)多的ROS,從而造成機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷[10]。人參中的多糖,皂苷以及多肽等物質(zhì),都能提高機(jī)體的氧化應(yīng)激能力,記憶力以及非特異性免疫能力,楊迎等通過(guò)將人參皂苷Rg1和Rb1飼喂幼鼠后發(fā)現(xiàn),其能夠促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育并且有一定的促進(jìn)生長(zhǎng)的作用,同時(shí)這種效果能夠延續(xù)到小鼠成年[11];另一項(xiàng)研究表明,注射Rg1和Rb1能夠加強(qiáng)小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的空間學(xué)習(xí)記憶能力[12]。夏菁等研究表明,Rg1能夠誘導(dǎo)人紅白血病TF-1細(xì)胞凋亡,其主要的機(jī)制是Rg1能夠參與JAK通路中蛋白磷酸化,并下調(diào)其下游相關(guān)的基因,從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[13]。本研究中4%Rs組對(duì)Pb暴露后氧化應(yīng)激指標(biāo)顯著提高,其主要原因可能是因?yàn)槿藚⒍嗵呛腿藚⒃碥仗岣吡思?xì)胞Nrf2的表達(dá),從而使細(xì)胞抗氧化能力升高,而2%Rs、6%Rs、8%Rs添加組細(xì)胞抗氧化能力提高不明顯,2%Rs添加組可能是人參皂苷和人參多糖量不足以調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)所致,而6%Rs、8%Rs添加組細(xì)胞抗氧化能力提高不明顯可能是由于添加過(guò)量,從而影響了細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝所致,但具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

      金屬硫蛋白(MT)是參與體內(nèi)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)平衡的重要蛋白,同時(shí)其在解毒以及氧化應(yīng)激中也發(fā)揮著重要作用。研究都表明,當(dāng)水生動(dòng)物暴露重金屬后,MT基因在不同組織中的表達(dá)與重金屬的暴露存在顯著的相關(guān)性,也因而被用來(lái)作為生物標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)水環(huán)境中重金屬的污染。MT基因在參與離子平衡時(shí)會(huì)移除機(jī)體非必須的金屬,并且研究表明,重金屬暴露魚(yú)類(lèi)后會(huì)使MT基因的表達(dá)上升[14],Kim等(2016)通過(guò)利用維生素C和鉛同時(shí)暴露許氏平鲇后發(fā)現(xiàn),維生素C能夠減弱鉛對(duì)MT基因誘導(dǎo)升高作用[7]。李建平(2011)等研究表明,人參多糖能夠調(diào)節(jié)人白細(xì)胞K562基因表達(dá)譜的改變[15]。本研究中,MT基因的表達(dá)量,相對(duì)于對(duì)照組,各組(Pb組、2%Rs組、4%Rs組、6%Rs組、8%Rs組)MT基因表達(dá)量分別提高4.2、2.55、1.97、2.58倍和2.57倍。4%Rs 添加時(shí)MT基因的表達(dá)量顯著降低(P< 0.05),這可能是由于人參浸出液的添加提高了MT基因活性,使機(jī)體能夠轉(zhuǎn)運(yùn)足夠的必須金屬,來(lái)減弱了Pb誘導(dǎo)的MT的提升作用,2%Rs可能是由于添加量過(guò)少不足以誘導(dǎo)MT活性,6%Rs和8%Rs可能由于過(guò)量的添加導(dǎo)致影響了細(xì)胞正常代謝,抑制了MT基因的活性。

      綜上所述,不同濃度Rs能夠緩解Pb誘導(dǎo)GCO細(xì)胞毒性,4%Rs添加時(shí)最佳。

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