金昊吳昊卓越洪文嘉鄭考唐霄雯鄭斌嬌*

1浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點實驗室(溫州325035)

2溫州醫(yī)科大學(xué)Attardi線粒體生物醫(yī)學(xué)研究院(溫州325035)

1 基因表達(dá)譜相關(guān)技術(shù)

ISH是一項原始的基因表達(dá)譜技術(shù)，將特異探針與組織、細(xì)胞或染色體上目的核酸互補(bǔ)配對形成專一的核酸雜交分子，后經(jīng)一定的檢測手段將目的核酸的位置顯示出來。但是由于研究范圍的局限性，只能研究單個或小群體基因的表達(dá)，所以當(dāng)高通量基因表達(dá)分析技術(shù)出現(xiàn)后迅速被取代。DNA微陣列技術(shù)通過小范圍內(nèi)大量目的DNA與探針之間的雜化，可以快速準(zhǔn)確地分析出靶向物整個轉(zhuǎn)錄組的基因表達(dá)水平，因此能識別出更多目的基因調(diào)控的潛在靶基因。

NGS的出現(xiàn)推動了不需要探針的新技術(shù)的發(fā)展，同時具備成本低、時間短和精度高等優(yōu)點?；虮磉_(dá)系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）技術(shù)將cDNA作為多連體進(jìn)行切割和測序，產(chǎn)生獨特的表達(dá)序列標(biāo)簽，從而近乎完整地獲得全基因組表達(dá)信息。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA sequencing,RNA-Seq）是NGS的最新研究成果，它通過高通量測序技術(shù)檢測出轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)水平，從而幫助認(rèn)識目的基因的結(jié)構(gòu)與功能。

第三代測序技術(shù)SMS不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，主要有Helicos的單分子測序技術(shù)（ture single molecule sequencing,TSMS）、PacBio的單分子實時測序技術(shù)(single molecule real time,SMRT)和Oxford Nanopore的納米孔單分子測序技術(shù)（也有稱第四代測序技術(shù)）。前兩者的原理相同：通過熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸摻入目的DNA檢測，熒光基團(tuán)一旦和DNA形成化學(xué)鍵即消失，因此不會影響目的DNA。納米孔單分子測序技術(shù)的核心是一塊由α-溶血素組成的并結(jié)合有核酸外切酶的納米孔道，靶向物穿過孔道時每一個堿基就會產(chǎn)生一個特異阻斷電流，由此獲得靶向物序列。目前，SMS仍在高速發(fā)展過程中，也許在未來幾年NGS主導(dǎo)的基因表達(dá)譜應(yīng)用格局還會延續(xù)，但是完善的SMS平臺必將引領(lǐng)生物學(xué)界向更深層次發(fā)展。

2 基因表達(dá)譜對研究毛細(xì)胞再生的作用

毛細(xì)胞是聽覺感受器，在人體內(nèi)數(shù)目不斷減少，但部分動物的毛細(xì)胞具有再生功能。Hawkins等利用適用于禽類橢圓囊和基底乳頭感覺上皮細(xì)胞的特異性探針檢測人的DNA序列，首次明確了禽類作為識別哺乳動物潛在耳聾位點的模型的作用[1]。在遺傳病變尚未明確時，可以通過這種方法識別一些未知的耳聾表達(dá)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。Hawkins等分別用新霉素和激光消融處理毛細(xì)胞，研究禽類橢圓囊和基底乳頭的再生感覺上皮基因譜，發(fā)現(xiàn)許多保守的信號通路、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期過程中與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因在再生階段會受到不同程度的調(diào)控[2]。近年來也有研究者通過RNA-Seq分析幼雞橢圓囊以識別氨基糖甙類處理后毛細(xì)胞再生的轉(zhuǎn)錄組，共識別出約500個新的特異毛細(xì)胞基因以及超過200個處于再生階段的差異轉(zhuǎn)錄因子[3]。

斑馬魚是研究毛細(xì)胞再生的熱門模型。研究者使用NGS確定了受噪音損傷的成年斑馬魚的毛細(xì)胞再生基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)stat3/socs3信號通路是這一過程中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)器[4]。魚的側(cè)線器官中也存在毛細(xì)胞，因此也常被用于毛細(xì)胞再生研究。Bao等發(fā)現(xiàn)H3K27me3去甲基化酶受到抑制后，誘發(fā)毛細(xì)胞凋亡并降低其再生能力[5]。Mizutari等發(fā)現(xiàn)魚的Notch信號通路在毛細(xì)胞損傷后下調(diào)，提示哺乳動物和非哺乳動物之間的差異比較可能可以揭示毛細(xì)胞再生的潛在性[6]。

表1 特定內(nèi)耳組織和細(xì)胞類型的基因譜相關(guān)技術(shù)Table 1 Gene prof i ling of specif i c tissues and cell types

3 基因表達(dá)譜對分析特定內(nèi)耳組織和細(xì)胞類型的作用

明確特定組織和細(xì)胞層面的轉(zhuǎn)錄譜能全面地了解內(nèi)耳分子功能，但是因為組織稀缺以及內(nèi)耳細(xì)胞類型復(fù)雜等因素很難實現(xiàn)。Sajan等使用高精度的微陣列技術(shù)率先完成了對小鼠內(nèi)耳從第9胚胎日到第15胚胎日分化過程的基因綜合分析，并且識別出50余種信號通路[7]。從此，基因譜技術(shù)由于其準(zhǔn)確性和高效性而被廣泛用于特定內(nèi)耳組織和細(xì)胞類型的研究（表1[8-16]）。Cristobal等首次將激光捕獲顯微切割技術(shù)應(yīng)用在成年大鼠的壺腹嵴，發(fā)現(xiàn)了超過400種支持細(xì)胞和毛細(xì)胞的基因表達(dá)差異[13]。McDermott等通過將斑馬魚體內(nèi)分離的毛細(xì)胞和肝臟的mRNA雜交，得到寡核苷酸DNA微陣列，識別出包括毛細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組在內(nèi)的超過1000個基因[14]。Kurima等分析發(fā)現(xiàn)在內(nèi)耳感覺上皮優(yōu)勢表達(dá)的基因啟動子處，鋅指轉(zhuǎn)錄因子Zeb1結(jié)合位點發(fā)生變化，這可能是Zeb1小鼠突變體發(fā)育階段形成畸形內(nèi)耳以及包括Zeb1結(jié)合位點在內(nèi)的很多基因在突變體中出現(xiàn)異常的誘因[8,17]。另一項研究使用流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)（f l uorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）純化新生小鼠耳蝸的毛細(xì)胞和周圍非感覺群體，結(jié)果純化后的耳蝸支持細(xì)胞和小上皮嵴細(xì)胞增殖分化，說明它們的再生能力和周圍的毛細(xì)胞存在差異[9]。Lu等確定了FACS純化后從軸突延伸到螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的聽覺生成發(fā)展過程的完整表達(dá)譜，促進(jìn)了特異性轉(zhuǎn)錄和軸突導(dǎo)向因子的識別[10]。Haraksingh等通過外顯子組測序技術(shù)和DNA微陣列技術(shù)對3個攜帶肌球蛋白重鏈7B（myosin heavy chain 7B，MYH7B）基因的耳聾家系進(jìn)行研究，首次發(fā)現(xiàn)一個包含吡哆醛依賴性脫羧酶結(jié)構(gòu)域含蛋白1（pyridoxal-dependent decarboxylase domain containing 1，PDXDC1）基因的染色體片段在患病家系成員中顯著缺失[18]。

4 基因表達(dá)譜對研究突變小鼠的作用

迄今為止基因譜技術(shù)最廣泛的應(yīng)用之一就是通過小鼠突變體和野生型動物的比較分析來識別基因突變引起表達(dá)改變的潛在靶基因，闡明參與內(nèi)耳發(fā)育、毛細(xì)胞再生和耳聾發(fā)病機(jī)理等不同過程的潛在分子機(jī)制。

Urness等將不會誘導(dǎo)內(nèi)耳發(fā)育的成纖維細(xì)胞生長因子3（f i broblast growth factor,FGF3）和FGF10雙突變體作為研究內(nèi)耳感應(yīng)基因的一種模型，通過對耳區(qū)進(jìn)行RNA ISH證明一些基底特定基因表達(dá)下調(diào)[19]。同時FGF3和FGF10的缺失也與后腦表達(dá)Wnt8的下調(diào)有關(guān)，這也使耳基板FGF的誘導(dǎo)形成與它對菱腦原節(jié)4或5-6節(jié)后部的限制之間建立聯(lián)系。Hertzano等首次對缺乏毛細(xì)胞存活所需轉(zhuǎn)錄因子Pou4f3的小鼠突變體內(nèi)耳進(jìn)行DNA微陣列分析，識別并確認(rèn)了編碼轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白的生長因子獨立因子1（growth factor independent factor 1,Gfi1）是Pou4f3的靶向物[20]。Matern等對Gfi1突變小鼠進(jìn)行RNA-Seq檢測，顯示早發(fā)性聽力損傷和毛細(xì)胞再生功能缺陷[21]。Kammerer使用ISH發(fā)現(xiàn)癌胚抗原細(xì)胞粘附分子會導(dǎo)致哺乳動物聽覺上出現(xiàn)低、高頻率損傷[22]。Tekin等使用全基因組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)耳聾小鼠存在跨膜蛋白SLITRK6突變，提示其可能影響聽覺神經(jīng)在突觸的轉(zhuǎn)運(yùn)過程[23]。

很多研究已經(jīng)通過小鼠突變體說明毛細(xì)胞基因表達(dá)缺失的后果。Libby等對攜帶肌球蛋白XV基因突變的shaker2突變小鼠進(jìn)行了實驗，發(fā)現(xiàn)該突變導(dǎo)致毛細(xì)胞靜纖毛缺陷的同時引起耳聾[24]。缺少視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因（retinoblastoma gene,Rb1）的小鼠突變體耳蝸毛細(xì)胞受到損傷，但橢圓囊中的毛細(xì)胞不受影響[25]。一項DNA微陣列的比較分析顯示，Rb1突變耳蝸中參與Wnt和Notch信號通路的轉(zhuǎn)錄增加，而橢圓囊中細(xì)胞增殖和存活相關(guān)轉(zhuǎn)錄更為活躍[26]。胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1,IGF-1）的缺失會導(dǎo)致人和小鼠耳聾，IGF-1突變小鼠耳蝸的基因譜顯示轉(zhuǎn)錄因子FoxM1、Six6和Mash1上調(diào)[27]。縫隙連接蛋白30（connexin 30,Cx30）的缺失會導(dǎo)致血管紋電位調(diào)控功能破壞并引起突變小鼠耳聾[28]。高半胱氨酸是內(nèi)皮功能障礙的相關(guān)因子，也可作為支持血管紋的毛細(xì)血管屏障，Cx30突變體小鼠的DNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)高半胱氨酸的增加[29]。

5 基因表達(dá)譜對認(rèn)識年齡相關(guān)性聽覺喪失的作用

環(huán)境的改善和藥物水平的提高延長了人類的壽命，但是這也導(dǎo)致和年齡相關(guān)的感覺功能障礙在全世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢。老年性聾是最普遍的具有年齡特征的感覺功能障礙。最近一項研究比較了年齡相關(guān)性聽覺喪失的DBA/2J型小鼠在2個月和8個月時耳蝸基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大量8個月大的小鼠出現(xiàn)年齡相關(guān)性耳聾癥狀[30]。耳蝸的DNA微陣列分析顯示，這些小鼠身上出現(xiàn)的年齡相關(guān)性聾與耳蝸中調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈復(fù)合體的基因顯著下調(diào)有關(guān)。因為聽覺隨壽命不斷喪失，γ-氨基丁酸受體表達(dá)水平在CBA小鼠（一種人老年性耳聾的模型）中受到不同程度的調(diào)控。對該模型進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和抗氧化系統(tǒng)對老年性聾的影響[31]。Marano等報道了引起催乳素和生長激素強(qiáng)烈上調(diào)的年齡相關(guān)基因表達(dá)的變化[32]。另有研究表明缺少三葉因子3（trefoil factor 3,Tff3）肽的小鼠會遭受年齡相關(guān)的聽力喪失，DNA微陣列分析則顯示轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)保全素Pttg1和蛋白酶抑制劑serpina3n能夠有效減弱這種損傷[33]。其他研究者也發(fā)現(xiàn)谷氨酸相關(guān)基因表達(dá)隨著年齡增長發(fā)生改變，提示其可能對年齡相關(guān)性聾產(chǎn)生影響[34-35]。

6 基因表達(dá)譜對了解內(nèi)耳損傷調(diào)控機(jī)制的作用

內(nèi)耳感音神經(jīng)功能可能因為直接病變、過度噪音干擾或者藥物干預(yù)造成損傷。對大鼠耳蝸的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激相關(guān)基因等基因在噪音暴露下數(shù)小時后表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象，持續(xù)受到損傷24小時后，抗氧化和炎癥的通路增加[36]。Cai等通過RNA-Seq獲得了小鼠免疫系統(tǒng)相關(guān)基因分子譜，發(fā)現(xiàn)噪音強(qiáng)度干擾了用于支持細(xì)胞的Toll樣受體信號通路的基因轉(zhuǎn)錄水平[37]。Park等在連續(xù)噪音損傷的小鼠模型中對半胱氨酰白三烯信號進(jìn)行了檢測，觀察到半胱氨酰白三烯受體1型（cysteinyl leukotriene type 1 receptor,CysLTR1）在螺旋器中增多。在噪音損傷后使用白三烯受體拮抗劑（leukotriene receptor antagonist,LTRA）進(jìn)行治療有效降低了毛細(xì)胞損傷，同時觀察到聽閾降低[38]。

體外形成的聽覺毛細(xì)胞需要NF-kappaB信號才能存活，NF-kappaB復(fù)合體還能參與細(xì)胞對有害刺激的免疫反應(yīng)。Nagy等通過DNA微陣列探索此通路下游的轉(zhuǎn)錄變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)效應(yīng)分子磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）調(diào)節(jié)亞基上調(diào)[39]。耳蝸中NF-kappaB抑制劑處理引起的PI3K通路障礙導(dǎo)致促凋亡基因Caspase-3的活化，揭示了毛細(xì)胞存活過程中各通路間的聯(lián)系。

7 基因表達(dá)譜對分析藥物影響的作用

抗利尿激素（anti-diuretic hormone,ADH）是由調(diào)控身體水含量的神經(jīng)垂體分泌的一種激素。通過基因表達(dá)譜分析，注射ADH對基因表達(dá)的影響得到證實。內(nèi)淋巴液產(chǎn)量增加或吸收減少會導(dǎo)致水通道蛋白表達(dá)的變化，而水通道蛋白基因表達(dá)水平的改變也和老年性耳聾的形成有關(guān)[40]。

由于具有抗炎作用，地塞米松等糖皮質(zhì)激素也被用于治療急性感覺神經(jīng)性聽力損失。在小鼠耳蝸中，地塞米松會對基因表達(dá)造成干擾，具有抗炎、細(xì)胞應(yīng)激或防止氧化損傷的潛在細(xì)胞保護(hù)作用的基因表達(dá)也受到影響[41]。Takumi等將地塞米松作為豚鼠耳蝸移植物的一部分置于在地塞米松洗脫電極的環(huán)境中，再將正常電極和未處理的耳蝸基因譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)攜帶地塞米松洗脫電極的動物顯示出移植物引起的免疫反應(yīng)相關(guān)基因下調(diào)的趨勢[42]。

高劑量的氨基糖甙類抗生素會誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞的凋亡。DNA微陣列分析慶大霉素處理后的大鼠外植體培養(yǎng)物，結(jié)果顯示由活性氧與N-甲基-D-天冬氨酸受體介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)[43]。DNA微陣列分析顯示水楊酸注射3小時后小鼠耳蝸中87種基因表達(dá)上調(diào)，提示藥物水楊酸在使用時可能引起暫時性聽力損失或者耳鳴[44]。

8 展望

近些年來以DNA微陣列和NGS為基礎(chǔ)的基因譜研究持續(xù)發(fā)展，并已開發(fā)出第三代測序技術(shù)，廣泛應(yīng)用于不同情況下組織或特定細(xì)胞類型的基因表達(dá)水平復(fù)雜性的分析。新的基因表達(dá)譜技術(shù)的發(fā)明不僅提供了快速獲取基因表達(dá)水平的簡單方法而且更加經(jīng)濟(jì)實惠。由于mRNA水平未必會對蛋白質(zhì)表達(dá)水平產(chǎn)生影響，在翻譯后可能出現(xiàn)蛋白質(zhì)磷酸化等進(jìn)一步變化，因此蛋白質(zhì)水平的變化必將成為下一個關(guān)注重點。通過熒光差異雙向電泳技術(shù)（2D-DIGE）、抗體DNA微陣列技術(shù)或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以對大型蛋白質(zhì)組進(jìn)行操作分析。一些相關(guān)的內(nèi)耳研究已經(jīng)依靠這些技術(shù)在推進(jìn)，例如毛細(xì)胞帶狀突觸蛋白質(zhì)組和纖毛的確定以及耳蝸的耳毒性或噪音傷害的影響等。因此，未來的內(nèi)耳研究很可能是以基因譜技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的基因分析組合，生物信息學(xué)工具的后續(xù)使用將根據(jù)單細(xì)胞分辨率實現(xiàn)對候選基因或潛在通路的快速識別，這些都將極大地推動內(nèi)耳的相關(guān)研究。