張曉偉，李廣平，劉彤

心房顫動（atrial fibrillation，AF）是一種以快速、無序電活動為特征的持續(xù)性心律失常，可顯著增加腦卒中和充血性心力衰竭的發(fā)生風(fēng)險，有很高的致殘和致死率［1］。AF 可以改變心房原有的電生理和組織學(xué)特征，即出現(xiàn)心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)，形成一種更有利于AF 觸發(fā)和維持的基質(zhì)。心房重構(gòu)的早期主要以電重構(gòu)為主，表現(xiàn)為有效不應(yīng)期縮短和頻率適應(yīng)性下降，晚期則出現(xiàn)顯著的結(jié)構(gòu)重構(gòu)，主要表現(xiàn)為心房肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等超微結(jié)構(gòu)的改變，并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡、蛋白沉積、間質(zhì)纖維化等［2］。研究表明，心房重構(gòu)的發(fā)生與心房肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等機(jī)制有關(guān)［3］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是調(diào)控細(xì)胞蛋白合成、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、氧化應(yīng)激水平、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號通路的重要細(xì)胞器［4］。近年來，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在心房重構(gòu)及AF的發(fā)生和發(fā)展中的作用日益受到重視。本文對ERS和AF研究進(jìn)展作一綜述。

1 ERS

ER是細(xì)胞中最大的膜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，也是細(xì)胞內(nèi)主要的Ca2+庫，其腔內(nèi)較胞質(zhì)呈高氧化狀態(tài)，參與蛋白質(zhì)合成與修飾、類固醇物質(zhì)的代謝及細(xì)胞內(nèi)信號處理。同時，ER 又是細(xì)胞應(yīng)對外界刺激的主要細(xì)胞器，通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)來適應(yīng)環(huán)境的變化，構(gòu)成細(xì)胞重要的防御機(jī)制。在缺血缺氧、氧化應(yīng)激、異常糖基化反應(yīng)以及Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡等因素刺激下，ER的正常功能被干擾，大量蛋白質(zhì)被錯誤折疊，導(dǎo)致未折疊蛋白質(zhì)（unfolded protein）在ER中堆積，促使ER啟動應(yīng)急響應(yīng)機(jī)制來緩解未折疊蛋白質(zhì)的壓力，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和正常功能，此過程即為ERS［5］。目前認(rèn)為ERS 主要包含兩條途徑，即未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過載反應(yīng)（ER overload response，EOR），以上兩條途徑并無時間先后順序。UPR 可上調(diào)蛋白折疊相關(guān)基因的表達(dá)，提高蛋白質(zhì)正確折疊能力；調(diào)節(jié)蛋白翻譯速率，抑制蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和聚集；促進(jìn)錯誤折疊蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解（ER associated degradation,ERAD），提高自身修復(fù)能力［5］。EOR 則通過核因子κB（NF-κB）介導(dǎo)的信號通路促進(jìn)炎癥激活和細(xì)胞增殖［6］。

1.1 UPR ER 合成和修飾蛋白的功能依賴于分子伴侶、折疊酶和豐富的Ca2+環(huán)境，當(dāng)ER 腔內(nèi)未折疊形態(tài)的蛋白聚集時，固有的分子伴侶蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Glucose-regulated protein 78/ Binding protein，GRP78/Bip）從ER 跨膜蛋白的ER 腔面解離下來，結(jié)合到未折疊蛋白。跨膜蛋白在與分子伴侶GRP78 解離后被活化，啟動UPR。其中最重要的3種ER 跨膜蛋白是蛋白激酶R 樣ER 激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）、肌醇需要酶（inositol requiring kinase，IRE1）和活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6），它們分別介導(dǎo)3條不同的信號通路［7］。

1.1.1 PERK PERK是絲/蘇氨酸蛋白激酶，通過寡聚化和磷酸化激活，使其下游的真核細(xì)胞翻譯起始因子（eukaryotic initiation factor 2, elF2α）磷酸化，造成elF2α 不能被重復(fù)利用，因而使mRNA 的翻譯速率廣泛下調(diào)，新合成的蛋白減少，ER 的蛋白負(fù)荷減輕。與此相伴隨的是一些抗應(yīng)激蛋白和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的mRNA 被優(yōu)先翻譯，例如活化轉(zhuǎn)錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4）。ATF4 可上調(diào)C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）的表達(dá)，激活ER介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［8］。

1.1.2 IRE1 IRE1是一種含有α和β兩種亞型的跨膜蛋白，含有絲/蘇氨酸激酶區(qū)和核酸內(nèi)切酶區(qū)，通過寡聚化和磷酸化激活。IRE1 激活后通過其核酸內(nèi)切酶活性剪切X-盒結(jié)合蛋白-1（X-box binding protein 1,XBP1）mRNA 的前體，切除含有26 個堿基對的內(nèi)含子序列，使其成為成熟mRNA 并翻譯為XBP1蛋白［9］。XBP1及其剪接體結(jié)合ERS反應(yīng)元件（endoplasmic reticulum stress element，ERSE）的啟動子區(qū)，上調(diào)GRP78、CHOP 等ERS 相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)ER蛋白折疊和ERAD功能［10］?；罨腎RE1還可通過與胞漿酶結(jié)構(gòu)域招募接頭分子TRAF2（TNF-receptor-associated factor 2）結(jié)合而激活A(yù)SK1（apoptosis signaling kinase 1），并級聯(lián)激活JNK（c-Jun N-terminal kinase）和NF-κB而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

1.1.3 ATF6 ATF6 是真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅱ型跨膜蛋白，其N 端是胞質(zhì)含b-ZIP 的轉(zhuǎn)錄激活功能域，C端是位于ER腔內(nèi)應(yīng)激響應(yīng)結(jié)構(gòu)域。通常情況下，ATF6 通過GRP78 對高爾基體定位信號（golgi localization signal，GLS）的抑制作用而停留在ER 膜上。GRP78與ATF6解離后，后者暴露出GLS而移位到高爾基體上，在高爾基體Site-1/2蛋白酶的水解作用下釋放出N-端胞漿區(qū)，成為具有轉(zhuǎn)錄活性的片段?；罨腁TF6 以同源或異源二聚體的形式結(jié)合于啟動子ERSE，誘導(dǎo)XBP-1 轉(zhuǎn)錄表達(dá)，上調(diào)GRP78、CHOP 等基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)蛋白在ER腔內(nèi)的正確折疊和介導(dǎo)凋亡［11］。如果ER 處理蛋白折疊的能力不能恢復(fù)，失去維持ER腔內(nèi)氧化還原及Ca2+平衡的能力，則ER 損傷變?yōu)椴豢赡?，此時凋亡信號即被啟動［12］。

1.2 EOR 目前有關(guān)EOR的研究遠(yuǎn)不如UPR深入，Ca2+在EOR的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。EOR可以被ER腔內(nèi)過度積累的蛋白誘發(fā)，而并非需要未折疊蛋白。ER釋放腔內(nèi)的Ca2+，被線粒體攝取后產(chǎn)生活性氧簇（ROS），后者進(jìn)一步激活NF-κB信號通路［13］。NF-κB 可以上調(diào)多種轉(zhuǎn)錄因子而促進(jìn)增殖和炎癥。EOR 的具體機(jī)制，尤其是與細(xì)胞自噬之間是否存在關(guān)聯(lián)尚不清楚。有研究顯示EOR 可以抑制病毒蛋白復(fù)制，表明其作為一種快速抗病毒反應(yīng)而具有抗病毒作用［13］。

2 ERS介導(dǎo)AF的可能機(jī)制

2.1 UPR與AF 在各種致病因素的作用下，ER 的功能和結(jié)構(gòu)失衡，激活UPR，細(xì)胞翻譯速率下調(diào)，ER伴侶蛋白的表達(dá)上調(diào)，錯誤折疊的蛋白質(zhì)被降解。通常情況下，ERS可以通過激活UPR能成功恢復(fù)ER的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而維持細(xì)胞功能。研究發(fā)現(xiàn)，PERK的激活可以下調(diào)心力衰竭患者心肌鈉通道（Nav1.5）和快速激活鉀通道（Kv4.3）的表達(dá)而促進(jìn)心律失常的發(fā)生［14］。一項(xiàng)入選了239例接受心臟手術(shù)患者的研究中，通過對左心耳組織進(jìn)行全基因組mRNA 芯片分析發(fā)現(xiàn)，AF 易感性與幾種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子靶蛋白表達(dá)降低有關(guān)，其中包括ATF6等CREB/ATF家族成員，而離子通道表達(dá)的重塑則發(fā)生在持續(xù)性AF 患者，抑或是AF 所導(dǎo)致的離子通道表達(dá)變化的后果［15］，提示UPR功能的缺失不能有效維持ER 穩(wěn)態(tài)，是AF 發(fā)生的可能機(jī)制之一。充血性心力衰竭可以促進(jìn)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)而造成一種利于AF 促發(fā)和維持的心房基質(zhì)。有研究利用犬心室快速起搏造成的心力衰竭模型，通過對心房整體蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，起搏2 周后ERS 標(biāo)志性蛋白GRP78水平明顯增高［16］。Vitadello等［17］在山羊心房快速起搏模擬AF的模型中發(fā)現(xiàn)，起搏4周以后ERS相關(guān)蛋白GRP94水平較正常心房組織升高2倍，在心房肌細(xì)胞未出現(xiàn)不可逆損傷前復(fù)律，8周后心房組織GRP94水平恢復(fù)至基線水平；而在慢性AF患者心房組織中同樣發(fā)現(xiàn)，GRP94蛋白水平較非AF患者顯著升高，因此認(rèn)為，雖然GRP 對Ca2+的親和力低，但是其能夠結(jié)合大量Ca2+，GRP94升高可能通過其分子伴侶功能而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白聚集，促進(jìn)正常折疊，也可能通過其Ca2+結(jié)合位點(diǎn)參與恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，從而提高心房肌細(xì)胞的生存率。也有研究發(fā)現(xiàn)，AF與ERS時UPR的過度激活有關(guān)。在一項(xiàng)高頻刺激HL-1 心房肌細(xì)胞模擬AF 的研究中發(fā)現(xiàn)，GRP78蛋白與對照組相比表達(dá)明顯增加，UPR中3 條經(jīng)典途徑p-PERK、p-IRE-1 及ATF6 蛋白水平均顯著升高，而在應(yīng)用ERS 抑制劑4-苯基丁酸（4-PBA）后上述蛋白表達(dá)水平明顯被抑制，并且高頻刺激引起的HL-1細(xì)胞凋亡也被顯著抑制［18］。

2.2 ERS 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與AF ERS 誘導(dǎo)的凋亡存在多種途徑，包括CHOP 通路、Caspase-12 的活化、JNK 通路、Bcl-2 蛋白家族以及Ca2+等。轉(zhuǎn)錄因子CHOP被認(rèn)為是介導(dǎo)ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的最具特征性的信號通路，UPR中PERK、IRE-1及ATF6均可以誘導(dǎo)CHOP 表達(dá)，但PERK-eIF2α-ATF4 是CHOP蛋白表達(dá)所必需的［19］。CHOP促凋亡的具體機(jī)制尚不完全清楚，主要通過對促凋亡和抗凋亡基因的直接和間接調(diào)控來介導(dǎo)細(xì)胞凋亡?；罨腎RE1 通過與TRAF2 及ASK1 相互作用激活JNK，后者從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核后通過磷酸化激活c-jun、c-Fos、EIK-1 等凋亡相關(guān)靶基因而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［20］。ERS 能夠通過多種途徑使ER 膜上的caspase-12（人類為caspase-4）活化，其促凋亡作用不依賴于其他途徑，而是直接激活下游的caspase-3 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［21］。Bcl-2 蛋白家族分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白兩大類，除線粒體外亦存在于ER膜上，調(diào)節(jié)ER內(nèi)Ca2+平衡，調(diào)控ERS 誘導(dǎo)物以及過度ROS 導(dǎo)致的細(xì)胞死亡［6］。此外，ERS 會導(dǎo)致ER 腔內(nèi)Ca2+外流，致使ER腔內(nèi)分子伴侶活性下降，進(jìn)一步加重ERS；同時細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高促進(jìn)依賴鈣離子/鈣調(diào)蛋白的蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）磷酸化，促進(jìn)氧化應(yīng)激，進(jìn)一步激活p-JNK、Fas等的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

心房肌細(xì)胞凋亡是心房纖維化的初始階段，被證實(shí)與AF 的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。Zhang等［22］研究發(fā)現(xiàn)，犬心房快速起搏可誘導(dǎo)衰老心房肌細(xì)胞表達(dá)單核細(xì)胞趨化蛋白-1 誘導(dǎo)蛋白（MCPIP），表現(xiàn)為嚴(yán)重的心房纖維化和心肌細(xì)胞凋亡，MCPIP升高程度與IRE1相關(guān)，提示其通過ERS導(dǎo)致心房肌細(xì)胞自噬和凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)，快速起搏HL-1心房肌細(xì)胞會出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與ERS 和UPR 被激活有關(guān)，通過上調(diào)具有促凋亡作用的CHOP 蛋白水平，以及線粒體凋亡途徑（mitochondrial apoptotic pathway，MAP）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在應(yīng)用ERS 抑制劑4-PBA 后ERS 相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞凋亡被顯著抑制［18］。Ghavami 等［23］在研究他汀類藥物對原代人心房成纖維細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)、生存和程序性死亡時發(fā)現(xiàn)，通過抑制HMG-CoA 還原酶，可誘導(dǎo)原代人心房成纖維細(xì)胞凋亡，其機(jī)制涉及ERS 和UPR 的過度激活。也有研究顯示，過氧化氫處理過的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯增加，ERS 相關(guān)蛋白GRP78、GRP94、CHOP 水平升高，應(yīng)用伊布利特可以通過抑制ERS而減輕心肌細(xì)胞凋亡［24］。

2.3 ERS 介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+超載與AF ER 具有很強(qiáng)的Ca2+緩沖能力，是細(xì)胞內(nèi)重要的“Ca2+庫”，其濃度比胞質(zhì)內(nèi)高數(shù)千倍。ER 腔內(nèi)Ca2+濃度的改變可以影響蛋白的合成，而未折疊蛋白的聚集又會破壞ER內(nèi)的Ca2+平衡。生理狀態(tài)下，ER中的Ca2+大部分呈游離狀態(tài)，主要通過蘭尼堿受體（RyR）和三磷酸肌醇受體（IP3R）兩種途徑進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，又可通過Ca2+泵（SERCA）由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入到ER 內(nèi)，共同維持Ca2+的動態(tài)平衡。ER內(nèi)還存在伴侶蛋白和緩沖分子等Ca2+結(jié)合蛋白，如集鈣蛋白（calsequestrin）、鈣網(wǎng)織蛋白（calreticulin），具有極強(qiáng)的Ca2+結(jié)合能力，對于維持ER內(nèi)Ca2+平衡極為重要。ER與線粒體之間通過特殊結(jié)構(gòu)存在局部聯(lián)系，Ca2+可從ER轉(zhuǎn)入線粒體中，調(diào)控心肌細(xì)胞線粒體能量代謝功能。在病理狀態(tài)下，ERS 激活，ER 內(nèi)Ca2+釋放，進(jìn)而大量Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)Ca2+超載，引起線粒體內(nèi)ATP能量合成減少，ER 內(nèi)Ca2+濃度降低抑制分子伴侶功能，ER初始蛋白質(zhì)折疊與合成能力受損；與此同時，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載激活ROS，誘導(dǎo)凋亡，后除極和折返增加，促進(jìn)心律失常的發(fā)生［25］。

心房肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載是AF 電重構(gòu)的主要機(jī)制。 Liu 等［26］發(fā)現(xiàn)PERK/鈣調(diào)蛋白磷酸酶（calcineurin，CN）信號途徑是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的一條新通路，與糖尿病心肌病相關(guān)心律失常發(fā)生有關(guān)，在糖尿病心肌病大鼠模型中，GRP78水平明顯增高，PERK 磷酸化水平及其下游CN 活性增高，可能通過促使RyR 受體開放而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，導(dǎo)致心律失常事件發(fā)生率明顯增加；應(yīng)用ERS 抑制劑4-PBA 或通過藥物及RNA 干擾抑制PERK 活性后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載減輕，GRP78 水平及心律失常事件顯著下降。另有研究發(fā)現(xiàn)，快速起搏HL-1心房肌細(xì)胞，激活ERS 及自噬，Ca2+電流振幅降低，應(yīng)用ERS抑制劑4-PBA、過表達(dá)ER分子伴侶蛋白熱休克蛋白A5、過表達(dá)eIF2α 磷酸化阻滯的突變體均可抑制ERS 及其下游激活的自噬，同時Ca2+瞬變減弱也被顯著抑制；在犬心房快速起搏模型中，4-PBA可顯著恢復(fù)心房肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，抑制ERS和自噬，改善心房肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)，抑制AF 進(jìn)展［27］。此外，在大鼠心房快速起搏模型中，GRP78、PERK、IRE-1、ATF6 以及另外一種ERS 蛋白Sestrin2 水平均升高，蘭尼堿2 受體（RyR2）磷酸化水平及Ca2+滲漏增加，其機(jī)制可能涉及Sestrin2 直接結(jié)合RyR2 上調(diào)RyR2磷酸化水平，提示Sestrin2通過調(diào)節(jié)RyR2參與ER應(yīng)激介導(dǎo)的AF［28］。

2.4 ERS、氧化應(yīng)激與AF ER 正常的生理功能與氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)，ER內(nèi)的高氧化狀態(tài)為新生肽鏈的正確折疊提供氧化動力。氧化應(yīng)激也是觸發(fā)ERS 的主要因素，ROS 可以直接攻擊維持蛋白折疊酶活性所必需的游離巰基，使得ER腔內(nèi)蛋白質(zhì)被氧化修飾，進(jìn)而誘導(dǎo)ER 折疊酶或分子伴侶的功能異常，引起未折疊蛋白的積累，從而激活UPR 及其下游凋亡通路。氧化還原狀態(tài)的改變以及ROS的存在也影響ER上的通道功能和伴侶蛋白的緩沖作用，進(jìn)而出現(xiàn)Ca2+超載。細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載不僅會激活下游信號通路進(jìn)而激活凋亡、誘導(dǎo)心律失常，又可進(jìn)入線粒體而增強(qiáng)其代謝，產(chǎn)生更多ROS。此外，ER 腔內(nèi)蛋白質(zhì)折疊過程中，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶接受從多肽底物半胱氨酸殘基的2個電子進(jìn)一步傳遞給氧形成H2O2，成為ER內(nèi)ROS的主要來源。

氧化應(yīng)激及ERS在心房肌細(xì)胞的重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在AF 的細(xì)胞模型中，快速起搏HL-1 心房肌細(xì)胞，ROS 水平、EOS 水平顯著增加，細(xì)胞存活率降低，而過表達(dá)ATF4 可引起凋亡相關(guān)的細(xì)胞應(yīng)激基因的表達(dá)，提示ROS 和ERS 引起心房肌細(xì)胞凋亡與誘導(dǎo)ATF4 的上調(diào)有關(guān)［29］。在小鼠主動脈弓縮窄模型中，心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)改變明顯，氧化應(yīng)激、炎癥和心房組織PERK、IRE1α、eIF2α、XBP1蛋白表達(dá)水平增高，可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑1-三氟甲氧基苯基-3-（1-丙?；哙?4-基）脲（TPPU）可明顯抑制氧化應(yīng)激和ERS 水平［30］。Wang 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，伊布利特治療AF 的可能機(jī)制之一是通過抑制心肌細(xì)胞ERS而降低氧化應(yīng)激水平。

3 總結(jié)

ERS 是細(xì)胞應(yīng)對外界刺激的主要應(yīng)激反應(yīng)之一，適度的ERS可通過UPR處理未折疊及錯誤折疊的蛋白恢復(fù)ER 穩(wěn)態(tài)，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，是一種保護(hù)性機(jī)制。然而，持久或嚴(yán)重的ERS 則可能造成蛋白合成、Ca2+穩(wěn)態(tài)及氧化還原失衡，引起細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致組織的損傷。目前ERS在AF發(fā)病機(jī)制中的研究尚不深入，但以上證據(jù)表明，ERS不足或過度激活可通過多種途徑介導(dǎo)AF 的發(fā)生以及心房肌細(xì)胞的重構(gòu)。隨著對ERS 研究的不斷深入，必將對AF的基礎(chǔ)及臨床研究產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。