崔苗苗，佟彥林，李 寧，蘇玉銘，魏 澍，任玉峰，李欣南，李 冰，周鐵忠?

（1.錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧 錦州 121001；2.遼寧省動物衛(wèi)生監(jiān)測預警中心，遼寧 沈陽 110001；3.遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧 沈陽 110161；4.遼寧省大連市動物疫病預防控制中心，遼寧 大連 116037；5.遼寧省獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心，遼寧 沈陽 110015）

沙門氏菌是引起人類和動物腸炎的主要致病菌之一，根據O抗原和H抗原的不同，可將其大約分為2 637個血清型[1]，沙門氏菌的各個血清型在自然界中引起人和動物的感染能力有所不同，只有一小部分才會引起感染[2]。雞沙門氏菌引起雞的3種類型疾病分別是雞白痢、禽傷寒和禽副傷寒，可通過種蛋垂直傳播，引起受精率和孵化率降低，雛雞生長遲緩和下痢，成年雞卵巢炎而產蛋下降，或肝臟破裂出血而死亡，是養(yǎng)禽業(yè)最常發(fā)的傳染病之一，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的損失。實際生產過程中，由于應用大量抗生素和化學性抗菌藥物對本病進行預防控制，造成了嚴重的細菌耐藥性和禽蛋肉產品中的藥物殘留，導致了本病的防治困難和食品安全問題[3]。為了預防新耐藥菌株的產生，更有效地治療雞腸炎沙門氏菌病，本試驗對遼寧某規(guī)模雞場進行了雞沙門氏菌鑒定分型和敏感藥物篩選，為雞沙門氏菌病的診斷和防治提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料的采集 于2017年9月，遼寧省錦州市某規(guī)模化養(yǎng)殖場，飼養(yǎng)的6 000只AA肉雞，有一棟約2 000只12日齡左右肉雞雛疑似雞沙門氏菌感染發(fā)病，選擇具有典型雞沙門氏菌臨床癥狀的病死雞100只，無菌取其肝臟、脾臟和腸道，冷藏送到實驗室用于分離細菌。

1.1.2 試驗動物 選擇某雞白痢凈化種雞場孵化的AA雄性肉雛雞，5日齡12只；經過雞白痢抗體檢測為陰性，經過支原體、ND、AI、雞球蟲病等其他病原檢測也均為陰性，作為分離菌株致病性試驗的試驗動物。

1.1.3 試驗試劑 營養(yǎng)瓊脂、SS培養(yǎng)基購于青島海博生物技術有限公司，Gill green核酸電泳染料、dNTP Mix、DL 2000購于北京百泰克有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；API NaCl 0.85%培養(yǎng)基和ID32E鑒定條均購自BIOMERIEUX公司；引物由南京思普金生物科技公司設計。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng)和形態(tài)觀察 無菌條件下，將100份病料劃線于SS鑒別培養(yǎng)基，37℃，培養(yǎng)18～24 h，挑取單個菌落，革蘭氏染色鏡檢，觀察細菌形態(tài)、顏色，反復此過程直至獲得純培養(yǎng)。

1.2.2 生化鑒定 將上述獲得的單菌落，在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線36±1℃培養(yǎng)24 h。將待檢細菌單個菌落，懸浮于3 mL懸浮培養(yǎng)基，制備0.5麥氏濃度的菌懸液，使用自動加樣器將菌懸液滴入試紙條反應杯中，每個反應杯中滴入55 μL，菌液和試劑滴加完畢后，37℃培養(yǎng)24 h，用細菌鑒定儀判讀。結果參考臨床微生物學診斷與圖譜[4]

1.2.3 基因鑒定分型

1.2.3.1 特異性引物的設計 鑒定雞腸炎沙門氏菌的特異性引物設計參照SH Park等[5]根據SefA gene，設計S.Enteritidis引物序列為：

STEF：5’-AACAACGGCTCCGGTAATGAGATTG-3’

STER：5’-ATGACAAACTCTTGATTCTGAAGATCG-3’

1.2.3.2 基因組DNA 將分離純化后的細菌，挑取單個菌落接種于的TSB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min震蕩4～5 h，肉眼觀察待菌液渾濁時，無菌挑取菌液進行涂片、染色、鏡檢，證實為純培養(yǎng)物，然后將純菌液按照《細菌基因組DNA提取試劑盒》（Solarbio）說明和步驟方法，提取細菌的基因組。

1.2.3.3 PCR擴增 以提取的基因組DNA為模板與合成的特異性引物進行PCR擴增。PCR反應體系為30 μL：菌液 DNA 模板 3 μL、2×Tap Master Mix 15 μL、上、下游引物各 1 μL、ddH2O 10 μL。PCR反應條件：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共30個循環(huán)；72℃最后延伸10 min。

將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶進行膠回收并送至生物公司測序，測序結果在Genbank中進行序列比對。

1.2.4 致病性試驗 選取5日齡雄性肉雞12只，隨機平均分為2組，對照組灌胃滅菌PBS溶液1 mL/只和試驗組灌胃3.2×108CFU/mL重懸菌液1 mL/只，灌胃后隔離飼喂，以防交叉感染，每隔4 h觀察1次，連續(xù)觀察72 h，并記錄試驗動物的發(fā)病以及死亡情況。將死亡的試驗雞剖檢，無菌采取肝臟、脾臟等病料，接種SS培養(yǎng)基，培養(yǎng)18～24 h后，使用革蘭氏染色，油鏡下觀察，從發(fā)病和死亡的試驗雞體內分離回收細菌。

1.2.5 藥敏試驗 將分離已鑒定的菌株進行14種抗菌藥物的藥敏檢驗，用凍干型細菌定量藥敏檢測盒進行抗菌藥物的敏感性檢測，參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）（2012）判定標準[6]，并對所檢測樣品進行結果判定和分析[7-8]。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養(yǎng)結果100份病料接種的SS培養(yǎng)基，有73個SS培養(yǎng)基上可看到呈露珠樣的細小、無色透明或中心略帶黑色光澤、圓整、濕潤并光滑，菌落的直徑大約有2～3 mm。使用革蘭氏染色法染色后鏡檢結果為：革蘭氏陰性、短桿菌、粉紅色、兩端稍圓，符合沙門氏菌的菌落及鏡檢特征。

圖1 雞沙門氏菌的生長狀態(tài)與形態(tài)結構Fig.1 Growth state and morphological structure of Salmonella

2.2 細菌生化試驗結果經生化試驗得到結果見表1。將此生化結果通過與臨床微生物學診斷與圖譜[4]比對發(fā)現符合沙門氏菌生化特征。

2.3 PCR鑒定結果PCR產物擴增電泳后，在約310 bp處出現目的片段，與腸炎沙門氏菌基因大小一致；陰性對照無條帶出現。

圖2PCR結果Fig.2 PCR results

表1 分離菌的生化結果Table 1 Biochemical results of isolates

2.4 致病性試驗結果接種分離菌的試驗雞于感染后12 h，羽毛污穢、精神沉郁、食欲下降、喜臥不愿意走動；感染后24 h，試驗雞拉白色或淡黃色稀糞，嚴重者肛門被糞便糊死；感染后36 h，試驗雞全部死亡，死亡率達到100%。死亡后，剖檢可見肝臟土黃色，有淤血斑點，脾臟腫大。在SS培養(yǎng)基上形成露珠樣無色透明、較小的菌落；鏡下觀察為陰性小桿菌，兩端稍圓，粉紅色；符合沙門氏菌生長情況和形態(tài)要求。通過以上各項檢測結果，證明所分離的細菌為雞源沙門氏菌。

2.5 藥敏試驗結果將分離已獲得的73株細菌進行14種抗菌藥物的藥敏檢驗，結果顯示，該分離菌對氨芐西林、磺胺異噁唑等耐藥性較強，而對頭孢噻呋、恩諾沙星等藥物的耐藥性較弱，具體如表2所示。

表2 腸炎沙門氏菌的藥敏試驗結果Table 2 Results of drug susceptibility test of S.Enteritidis

3 討論

3.1 關于沙門氏菌血清分型據報道雞源沙門氏菌血清型有腸炎、鼠傷寒、嬰兒、印第安納、雞白痢、肯塔基、德爾卑、湯卜遜、鴨、火雞、明斯特、胥伐成格隆等，雖然血清型種類繁多、菌株復雜，分布具有很強的區(qū)域特點，但以腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、印第安納沙門氏菌和德爾卑沙門氏菌等為主，優(yōu)勢血清型為腸炎、嬰兒、鼠傷寒、印第安納和雞白痢。遼寧省常發(fā)腸炎沙門氏菌、杜伊斯堡沙門氏菌、鵝沙門氏菌，本次鑒定腸炎沙門氏菌血清型在我國北京、上海、河北、山東地區(qū)均有報道[9-11]，沙門氏菌的血清型分布也具有明顯的地域性特點，腸炎沙門氏菌在北美地區(qū)的美國、加拿大，在歐洲的丹麥、荷蘭也有報道[12]。沙門氏菌血清型鑒定方法有傳統(tǒng)玻片凝集法、Luminex-xMAP法、免疫分析檢測技術、環(huán)介導等溫擴增、基因芯片技術（gene chip）、沙門氏菌的新型檢測技術（如生物傳感器檢測技術、納米技術等）。傳統(tǒng)的血清學鑒定方法操作簡便，但血清價格昂貴，鑒定過程步驟多，耗費時間長，要求試驗人員有豐富的經驗，即便如此，操作人員的主觀判斷仍有可能造成誤差。鑒于沙門氏菌血清型在流行病學研究中的重要性和傳統(tǒng)血清型鑒定方法的不足，研究人員開展了多種方法的研究以彌補傳統(tǒng)血清鑒定方法的不足。本研究是應用的是基于沙門氏菌fli C特異性基因建立的PCR法對沙門氏菌血清型進行鑒定分型，與其他研究者建立的方法相比，不僅具有反應快速、高效、靈敏和成本低的優(yōu)點，且理論上可以鑒定589種沙門氏菌血清型；只要有普通PCR儀的實驗室就可以開展沙門氏菌血清型的分型鑒定，能滿足一般實驗室的要求。

3.2 關于沙門氏菌的致病機制和致病性研究表明沙門氏菌的致病機制取決于其本身的毒力和宿主的結構，菌株的毒力由毒力因子決定，很多沙門氏菌的毒力因子最近才確定，如毒力島的毒力因子，由于毒力質粒、毒素、菌毛、鞭毛早已發(fā)現及研究了幾十年，所以被稱為傳統(tǒng)（典型）毒力因子。到目前為止只發(fā)現8種血清型含有毒力質粒。沙門氏菌既能產生內毒素也能產生外毒素，內毒素是沙門氏菌細胞壁的脂多糖成分，可以導致體內和體外多樣化反應。外毒素分為2種類型，包括細胞毒素（神經毒素）和腸毒素，目前關于沙門氏菌外毒素的作用方式了解非常有限。沙門氏菌入侵的最佳起始部位是濾泡上皮細胞，其次是在腸道上的派伊爾氏結上細胞，其位于腸道黏膜表面，所以其主要侵襲部位在腸道。關于沙門氏菌的致病性研究一直選擇健康SPF級小白鼠作為試驗動物[13-14]，而本次試驗首次選擇雛雞做為靶動物進行沙門氏菌的致病性研究，更能科學直接地驗證其致病性。張珍（2017）[15]研究表明雞源沙門氏菌對小鼠有較強的致病性，致死率達到60%～80%；本試驗選擇某雞白痢凈化種雞場孵化的，經過雞白痢抗體檢測為陰性，經過支原體、ND、AI、雞球蟲病等其他病原檢測也均為陰性的雄性雛雞，作為分離菌株致病性試驗動物，攻菌后36 h致死率達到100%，證明雞腸炎沙門氏菌遼寧流行菌株具有很強的致病性。

3.3 關于沙門氏菌的耐藥性現狀在遼寧錦州地區(qū)分離得到的腸炎沙門氏菌的藥敏結果與其他文獻報道的結果稍有不同，可能是由于血清型不同、細菌本身突變以及地區(qū)用藥的習性有關。劉新靜[16]2012～2014年在對從河北省幾個地區(qū)的養(yǎng)殖場分離出的142株雞沙門氏菌對15種藥物產生各種程度的耐藥，對磺胺異噁唑耐藥率為81.69%，四環(huán)素則為40.41%。王德寧[17]將來自哈爾濱疑似沙門氏菌感染的雞場分離到的44株菌株，進行了耐藥的分析試驗，結果顯示，氨芐西林對沙門氏菌具有最高的耐藥率，達到95.5%。韋婷[18]于2012～2013年期間檢測了四川地區(qū)市場雞肉中沙門氏菌的含量，結果其平均檢出率為28.0%；并對其做了耐藥性分析，數據顯示對3種以上抗生素耐藥的菌株達72.13%，最耐藥的抗生素為萘啶酸。關茹飛等[19]對烏魯木齊周邊雞場的沙門氏菌進行耐藥性檢測，檢測到的80株雞源沙門氏菌對環(huán)丙沙星和恩諾沙星的耐藥最為嚴峻。周榮云等[20]在揚州地區(qū)采集病料分離得到的21株鼠傷寒沙門氏菌，藥敏試驗結果表明對鏈霉素耐藥占42.86%，對復方新諾明占47.62%，10株分離株出現了多重耐藥現象。建議臨床上合理選擇并應用抗微生物類藥物，采取聯合用藥或者輪換用藥；降低細菌耐藥性的產生與發(fā)展，迫切需要開發(fā)抗感染中藥提取物以避免耐藥性產生和提高療效。沙門氏菌產生耐藥性是因為細菌本身能改變抗微生物藥的作用靶位，阻礙了抗微生物藥被識別[21]，動物機體對抗微生物藥的轉化利用率降低，治療效果不顯著，有些抗微生物藥甚至以原液直接通過糞便、尿液、唾液等方式排出體外，進而破壞了生態(tài)系統(tǒng)的平衡[22-25]，世界衛(wèi)生組織將沙門氏菌列入嚴重危害的食品傳播性病原體，迫在眉睫解決這個問題成為重中之重[26]。