王子薇，劉英博，于 洋，李敬雙，譚 超，呂疆蕾，孫媛媛，鄭榮美，屈 影

（錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001）

白藜蘆醇是非黃酮類(lèi)化合物，1940年，Tokaoka首次從毛葉藜蘆（Veratrum grandiflorum）的根部分離得到[1]，現(xiàn)在白藜蘆醇已在72種植物中被發(fā)現(xiàn)，如虎杖、葡萄科屬等。白藜蘆醇主要存在于花生、葡萄、桑樹(shù)和虎杖等植物中，其作為一種植物產(chǎn)生的抗毒素，可以抵抗外界病原體的入侵[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有抗炎、抗癌、抗衰老、提高免疫力、保護(hù)血管內(nèi)皮、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等作用[3-4]。馮永紅等[5]在低劑量白藜蘆醇增強(qiáng)小鼠免疫反應(yīng)研究中，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能促進(jìn)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖和IL-12的產(chǎn)生。Lee等[6]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能抑制金黃色葡萄球菌。雖然研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有一定增強(qiáng)免疫的作用，但在獸醫(yī)臨床上，白藜蘆醇的免疫增強(qiáng)活性少有報(bào)道。本研究通過(guò)體外分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響，探討白藜蘆醇的免疫調(diào)節(jié)活性，為白藜蘆醇的開(kāi)發(fā)和利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 8周齡健康SPF級(jí)Balb/c小鼠，體重20±2 g，購(gòu)于錦州醫(yī)科大學(xué)。

1.1.2 藥品和主要試劑 白藜蘆醇購(gòu)于曼斯特生物公司，RPMI-1640培養(yǎng)基和二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)于Solarbio公司，IL-3、IL-4、IL-12和IFN-γ試劑盒購(gòu)于博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 脾淋巴細(xì)胞懸液制備 小鼠頸椎脫臼法處死，浸泡于75%酒精消毒約3 min，在超凈臺(tái)內(nèi)剪開(kāi)小鼠腹壁，取出脾置于盛有磷酸鹽緩沖（PBS）的培養(yǎng)皿中，反復(fù)沖洗2次后置于RPMI-1640培養(yǎng)基中，用5 mL注射器抽取培養(yǎng)基吹打，重復(fù)上述操作直至脾外膜透明。將細(xì)胞懸液收集于離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入3 mL Tris-NH4Cl，吹勻，靜置5 min，離心，重復(fù)上述操作直至紅細(xì)胞全部裂解。細(xì)胞沉淀用RPMI-1640完全培養(yǎng)基懸起，臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)達(dá)到95%以上。調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL，制成脾淋巴細(xì)胞懸液[7-9]。

1.2.2 白藜蘆醇對(duì)脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響用24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL脾淋巴細(xì)胞懸液，設(shè)空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和白藜蘆醇不同濃度組，每組均設(shè)3復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組加1 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組加1 mL左旋咪唑溶液（終濃度為20 μg/mL），白藜蘆醇不同濃度組每孔分別加入1 mL含不同濃度的白藜蘆醇（使其終濃度分別為10、20、40和80 μg/mL）溶液，將24孔培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42 h，1 500 r/min離心5 min，收集上清于試管中。按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用酶標(biāo)儀于570 nm處檢測(cè)待測(cè)孔的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算IL-3、IL-4、IL-12和IFN-γ濃度[10-11]。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行一維方差分析組間差異顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇對(duì)脾淋巴細(xì)胞分泌IL-3的影響根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值繪制IL-3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，y=0.0137x，R2=0.955。白藜蘆醇對(duì)脾淋巴細(xì)胞分泌IL-3的影響見(jiàn)表1。

白藜蘆醇各濃度組與空白對(duì)照組比較：白藜蘆醇各濃度組IL-3的分泌均極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），表明白藜蘆醇能夠刺激淋巴細(xì)胞IL-3的分泌。

表1 白藜蘆醇對(duì)脾淋巴細(xì)胞分泌IL-3的影響Table 1 Effects of resveratrol on the secretion of IL-3 by spleen lymphocytes

白藜蘆醇各濃度組與陽(yáng)性對(duì)照組比較：20 μg/mL白藜蘆醇組IL-3的分泌顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），表明白藜蘆醇對(duì)刺激淋巴細(xì)胞IL-3的分泌作用的有效性。

白藜蘆醇各濃度組之間比較：20 μg/mL白藜蘆醇組IL-3的分泌極顯著高于其他濃度組（P＜0.01），隨著白藜蘆醇濃度增大IL-3分泌增多，在白藜蘆醇為20 μg/mL時(shí)IL-3分泌量達(dá)到最高，隨著白藜蘆醇濃度增大IL-3分泌量達(dá)到最低，呈雙向調(diào)節(jié)。

2.2 白藜蘆醇對(duì)脾淋巴細(xì)胞分泌IL-4的影響根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值繪制IL-4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，y=0.004x，R2=0.952。白藜蘆醇對(duì)脾淋巴細(xì)胞分泌IL-4的影響見(jiàn)表2。

白藜蘆醇各濃度組與空白對(duì)照組比較：白藜蘆醇各濃度組IL-4的分泌均極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），表明白藜蘆醇能夠刺激淋巴細(xì)胞IL-4的分泌。

白藜蘆醇各濃度組與陽(yáng)性對(duì)照組比較：10 μg/mL白藜蘆醇組IL-4的分泌低于陽(yáng)性對(duì)照組（無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05），20 μg/mL白藜蘆醇組IL-4的分泌高于陽(yáng)性對(duì)照組（無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05），表明白藜蘆醇對(duì)刺激淋巴細(xì)胞IL-4的分泌作用的有效性。

表2 白藜蘆醇對(duì)脾淋巴細(xì)胞分泌IL-4的影響Table 2 Effects of resveratrol on the secretion of IL-4 by spleen lymphocytes

白藜蘆醇各濃度組之間比較：20 μg/mL白藜蘆醇組IL-4的分泌極顯著高于其他濃度組（P＜0.01），隨著白藜蘆醇濃度增大IL-4分泌增多，在白藜蘆醇為20 μg/mL時(shí)IL-4分泌量達(dá)到最高，隨著白藜蘆醇濃度增大IL-3分泌量達(dá)到最低，呈雙向調(diào)節(jié)。

2.3 白藜蘆醇對(duì)脾淋巴細(xì)胞分泌IL-12的影響根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值繪制IL-12標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，y=0.009x，R2=0.964。白藜蘆醇對(duì)脾淋巴細(xì)胞分泌IL-12的影響見(jiàn)表3。

表3 白藜蘆醇對(duì)脾淋巴細(xì)胞分泌IL-12的影響Table 3 Effects of resveratrol on the secretion of IL-12 by spleen lymphocytes

白藜蘆醇各濃度組與空白對(duì)照組比較：白藜蘆醇各濃度組IL-12的分泌均極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），表明白藜蘆醇能夠刺激淋巴細(xì)胞IL-12的分泌。

白藜蘆醇各濃度組與陽(yáng)性對(duì)照組比較：10 μg/mL白藜蘆醇組IL-12的分泌低于陽(yáng)性對(duì)照組（無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05），20 μg/mL白藜蘆醇組IL-12的分泌高于陽(yáng)性對(duì)照組（無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05），表明白藜蘆醇對(duì)刺激淋巴細(xì)胞IL-4的分泌作用的有效性。

白藜蘆醇各濃度組之間比較：20 μg/mL白藜蘆醇組IL-12的分泌極顯著高于其他濃度組（P＜0.01），隨著白藜蘆醇濃度增大IL-12分泌增多，在白藜蘆醇為20 μg/mL時(shí)IL-12分泌量達(dá)到最高，隨著白藜蘆醇濃度增大IL-12分泌量達(dá)到最低，呈雙向調(diào)節(jié)。

2.4 白藜蘆醇對(duì)脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的影響根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值繪制IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，y=0.0008x，R2=0.950。白藜蘆醇對(duì)脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的影響見(jiàn)表4。

表4 白藜蘆醇對(duì)脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的影響Table 4 Effects of resveratrol on the secretion of IFN-γ by spleen lymphocytes

白藜蘆醇各濃度組與空白對(duì)照組比較：白藜蘆醇各濃度組IFN-γ的分泌均極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），表明白藜蘆醇能夠刺激淋巴細(xì)胞IFN-γ的分泌。

白藜蘆醇各濃度組與陽(yáng)性對(duì)照組比較：10、40 μg/mL白藜蘆醇組IFN-γ的分泌低于陽(yáng)性對(duì)照組（無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05），20 μg/mL白藜蘆醇組IFN-γ的分泌高于陽(yáng)性對(duì)照組（無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05），表明白藜蘆醇對(duì)刺激淋巴細(xì)胞IL-4的分泌作用的有效性。

白藜蘆醇各濃度組之間比較：20 μg/mL白藜蘆醇組IFN-γ的分泌極顯著高于其他濃度組（P＜0.01），隨著白藜蘆醇濃度增大IFN-γ分泌增多，在白藜蘆醇為20 μg/mL時(shí)IFN-γ分泌量達(dá)到最高，隨著白藜蘆醇濃度增大IFN-γ分泌量達(dá)到最低，呈雙向調(diào)節(jié)。

3 討論

細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答重要的蛋白分子，由活化的免疫細(xì)胞分泌。細(xì)胞因子分泌量多少可直接反映機(jī)體的免疫狀況。CD4+T細(xì)胞分為T(mén)h1型和Th2型細(xì)胞，IL-12和IFN-γ主要由Th1細(xì)胞分泌，IL-3和IL-4主要由Th2細(xì)胞分泌。IL-3由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，是機(jī)體反應(yīng)產(chǎn)生的抗炎性細(xì)胞因子，IL-4是受體α鏈和共同的g鏈之一組合的異質(zhì)二聚體，是一種重要的抗炎性細(xì)胞因子，具有免疫調(diào)節(jié)作用[12]。IL-12主要由免疫活性細(xì)胞分泌，具有調(diào)控細(xì)胞免疫功能，增強(qiáng)免疫效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞活性等作用[13-15]。IFN-γ又稱(chēng)Ⅱ型干擾素或免疫干擾素，主要由T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生，可以誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞的免疫應(yīng)答，具有免疫調(diào)節(jié)作用[16-17]。雷宇鵬等[18]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-12的分泌。曹喆燚等[19]發(fā)現(xiàn)紅酒中白藜蘆醇能促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ。上述文獻(xiàn)報(bào)道白藜蘆醇對(duì)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子分泌的影響都從單一細(xì)胞因子進(jìn)行研究，本試驗(yàn)檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)淋巴細(xì)胞分泌IL-3、IL-4、IL-12和IFN-γ等多種細(xì)胞因子的影響，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌IL-3、IL-4、IL-12和IFN-γ。提示白藜蘆醇通過(guò)激活靜止的T淋巴細(xì)胞，使其活化，免疫活性增強(qiáng)，T淋巴細(xì)胞只有受到抗原或有絲分裂原的刺激后才會(huì)合成和分泌細(xì)胞因子，由于Th1型細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，Th2型細(xì)胞因子介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，白藜蘆醇能夠同時(shí)促進(jìn)Th1型和Th2型細(xì)胞因子分泌，本試驗(yàn)結(jié)果與已報(bào)道的試驗(yàn)結(jié)果一致的，白藜蘆醇能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)與體液免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮免疫增強(qiáng)的作用。

4 結(jié)論

白藜蘆醇能誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞IL-3、IL-4、IL-12和IFN-γ細(xì)胞因子的分泌，從而提高淋巴細(xì)胞的免疫功能。