丁紅霞，景素琴，范佩麗，許 濤，魏 偉，劉少貞，宋 晶*

(1. 南風(fēng)化工集團(tuán)股份有限公司技術(shù)中心，山西 運(yùn)城 044000；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

呼吸和排泄是代謝的兩個(gè)重要組成部分，研究各種環(huán)境因子對(duì)耗氧和排氨的影響，有利于了解水生動(dòng)物代謝活動(dòng)的變化規(guī)律, 是生態(tài)能量學(xué)和營(yíng)養(yǎng)生理學(xué)研究的主要內(nèi)容，也是機(jī)體生理代謝和生長(zhǎng)狀況的重要指標(biāo)。耗氧率的大小及變化在很大程度上反映其代謝水平的高低及變化規(guī)律。排氨率則反映水生動(dòng)物的代謝特征、動(dòng)物自身的生理狀況和營(yíng)養(yǎng)狀況以及對(duì)外界環(huán)境條件的適應(yīng)能力。

鹵蟲是一種生活于高鹽度水體中的甲殼綱(Crustacea)動(dòng)物，隸屬于鰓足亞綱(Branchiopoda)，無(wú)甲目(Anostraca)鹵蟲科(Artemidae)，在世界沿海和內(nèi)陸鹽湖中廣泛分布。自1933 年Seale最先將鹵蟲無(wú)節(jié)幼體作為魚苗的開口餌料以來(lái)，鹵蟲卵廣泛應(yīng)用于海水魚、對(duì)蝦和河蟹育苗中，其年需求量也從剛開始的幾噸到目前的上萬(wàn)噸[1]。鹵蟲成蟲也是一種重要的水產(chǎn)餌料，其蛋白質(zhì)含量達(dá)60%以上，富含多種必需氨基酸、類胡蘿卜素、天然誘食劑等[2]。但近30年來(lái)，圍海造陸、鹽湖面積縮減、環(huán)境惡化、氣候劇變、鹽化工的發(fā)展，均使得產(chǎn)量原本就極不穩(wěn)定的鹵蟲和蟲卵資源更顯稀缺[3]。自20世紀(jì)80年代末，研究人員就一直在探索鹵蟲的養(yǎng)殖技術(shù)，并取得了很多重要成果。養(yǎng)殖替代捕撈，粗養(yǎng)向精養(yǎng)轉(zhuǎn)變是鹵蟲養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。

鹵蟲和其他其他甲殼動(dòng)物一樣，均為“排氨型動(dòng)物”，其呼吸生理研究一直受到國(guó)內(nèi)外研究者們的重視。目前，主要的研究工作多圍繞具有生態(tài)指示功能或具較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的甲殼類展開。之前的研究結(jié)果表明，甲殼動(dòng)物耗氧率和排氨率主要受到溫度[4-5]、光照[6]、基礎(chǔ)氧量[7-8]、鹽度[9-11]、緯度[12]、金屬離子[13-14]等環(huán)境因子的影響；不同的發(fā)育時(shí)期[15-17]、蛻殼[18]、選擇性穴居[19]等因子也會(huì)影響甲殼動(dòng)物耗氧率和排氨率。但對(duì)鹵蟲(Artemia salina)的此類研究尚屬空白，鹵蟲呼吸代謝的特性亟待確定。在生產(chǎn)周期中，水體溶解氧的飽和度隨水溫升高而降低，而水體中的化學(xué)耗氧量、養(yǎng)殖動(dòng)物和其它生物的耗氧量則隨溫度升高而增加。水中氧氣消耗，代謝產(chǎn)物積累誘發(fā)的水質(zhì)惡化，可能會(huì)使孤雌生殖的鹵蟲向兩性生殖轉(zhuǎn)變，這將對(duì)以收獲鮮鹵蟲為主的養(yǎng)殖生產(chǎn)造成不利影響。故該研究對(duì)主要環(huán)境因子對(duì)鹵蟲呼吸代謝的影響進(jìn)行初探，旨在掌握鹵蟲的相關(guān)生理特征，為推動(dòng)鹵蟲的集約化養(yǎng)殖積累原始資料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用鹵蟲均為成體，于2017-07取自南風(fēng)化工集團(tuán)鹵蟲養(yǎng)殖基地，選擇三種不同鹽度(14.0%、16.0%、19.4%)養(yǎng)殖水體中的鹵蟲進(jìn)行耗氧率和排氨率測(cè)定。窒息點(diǎn)、溫度、光照對(duì)耗氧率和排氨率的影響，均在鹽度14.0%測(cè)定。

1.2 窒息點(diǎn)的測(cè)定

鹵蟲窒息點(diǎn)的測(cè)定以125 mL具塞磨口試劑瓶為呼吸瓶。選用的鹵蟲均為成體，并在不同溫度(20 ℃、25 ℃、30 ℃)間進(jìn)行比對(duì)。每隔30 min觀察一次鹵蟲的行為和存活情況，當(dāng)半數(shù)受試動(dòng)物窒息時(shí)，立即連同受試動(dòng)物一起固定，以碘量法測(cè)定溶氧值[20]，作為鹵蟲的窒息點(diǎn)。

1.3 耗氧率、排氨率的測(cè)定方法

耗氧率、排氨率的測(cè)定采用容積1 100 mL的褐色廣口瓶作為呼吸室，每個(gè)實(shí)驗(yàn)單元，設(shè)置2個(gè)對(duì)照、3個(gè)平行。先將瓶中注滿采自養(yǎng)殖區(qū)、并經(jīng)過(guò)機(jī)械增氧的高氧鹽水(≥6 mg/L)，加入一定濕重的鹵蟲，加蓋排空氣體，水下密封實(shí)驗(yàn)，1 h后，以隔膜電極法[20]測(cè)定溶氧(臺(tái)灣衡欣，AZ-8403)，以改良次溴酸鹽氧化法[21]測(cè)定氨氮，分別用于計(jì)算耗氧率和排氨率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。各組數(shù)據(jù)在進(jìn)行方差分析之前，均先通過(guò)正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，組間差異進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan’s多重比較，顯著水平為P<0.05，極顯著水平為P<0.01。溫度對(duì)耗氧率和排氨率的影響，采用二項(xiàng)式回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度下鹵蟲的窒息點(diǎn)變化

在測(cè)定鹵蟲窒息點(diǎn)的過(guò)程中，其活動(dòng)規(guī)律與在自然條件下差異明顯(見表1)。但在試驗(yàn)過(guò)程中，與死亡狀態(tài)差異不明顯，故需要細(xì)心觀察。窒息點(diǎn)試驗(yàn)結(jié)果表明，鹵蟲在20 ℃、25 ℃和30 ℃的窒息點(diǎn)分別為1.15 mg/L、1.32 mg/L和1.69 mg/L。鹵蟲的窒息點(diǎn)與溫度高低密切相關(guān)，且窒息點(diǎn)隨著溫度的升高而升高，符合生物代謝規(guī)律(見圖1)。

表1 試驗(yàn)過(guò)程中鹵蟲的游泳行為變化Tab.1 The changes of swimming behavior in A. salinaduring the course of the experiment

圖1 三種不同溫度下鹵蟲的窒息點(diǎn)Fig.1 The asphyxiant point of A. salina at 3 different temperatures

2.2 光照對(duì)鹵蟲耗氧率和排氨率的影響

選取三組鹵蟲，在相同溫度(25.0 ℃)、鹽度(14.0%)但不同光照條件(0 lx、200 lx、1 000 lx)下，測(cè)定其耗氧率和排氨率，同時(shí)設(shè)置兩個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：鹵蟲的耗氧率在0 lx、200 lx、1 000 lx條件下的數(shù)值分別是1.134 mg/g·h±0.153 mg/g·h、1.480 mg/g·h±0.168 mg/g·h、1.552 mg/g·h±0.152 mg/g·h，顯然,鹵蟲的耗氧率隨著光照的增強(qiáng)而提高，有光照和無(wú)光照之間的耗氧率差異顯著，不同光照強(qiáng)度之間的耗氧率差異不顯著；排氨率在0 lx、200 lx、1 000 lx條件下的數(shù)值分別是155 μg/g·h±16.6 μg/g·h、176 μg/g·h±17.5 μg/g·h、198 μg/g·h±23.4 μg/g·h，可以看出鹵蟲的排氨率與光照強(qiáng)度成正相關(guān)關(guān)系，各組之間的排氨率差異顯著。3種鹽度下鹵蟲的耗氧率和排氨率見圖2。

圖2 3種鹽度下鹵蟲的耗氧率和排氨率Fig.2 The oxygen consumption rate and ammonia excretion rate in A. salina at 3 different salinities

2.3 溫度對(duì)鹵蟲耗氧率和排氨率的影響

結(jié)果表明，在20 ℃～40 ℃范圍內(nèi)，鹵蟲的耗氧率先上升，后下降，約在30 ℃～35 ℃達(dá)到峰值(見圖3A)；在20 ℃～40 ℃范圍內(nèi)，鹵蟲的排氨率持續(xù)上升(見圖3B)。對(duì)其變化規(guī)律進(jìn)行多種回歸分析，都有較好程度的擬合，但是二項(xiàng)式能夠獲得最高的回歸系數(shù)(R2)值，分別得出耗氧率和排氨率回歸方程為：OCR=-0.133 1x2+0.964 5x-0.190 4，R2=0.918 5；AER=-4.892 9x2+63.007x+26.3，R2=0.995 8。

2.4 鹽度對(duì)鹵蟲耗氧率和排氨率的影響

選取3種不同鹽度水體的鹵蟲，分別于常溫、常光下測(cè)定其耗氧率排氨率，結(jié)果表明，高鹽度組(19.4%)的耗氧率和排氨率在數(shù)值上均大于中(16.0%)、低(14.0%)度組，但差異不顯著(見圖4)。可能與鹵蟲具有良好的鹽度長(zhǎng)期適應(yīng)性和極強(qiáng)的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)能力相關(guān)。相比鹽度馴化，鹽度的驟變往往更能引起甲殼類的呼吸、排泄變化。

圖3 溫度對(duì)OCR和AER的影響Fig.3 Effect of temperature on OCR and AER

圖4 鹽度對(duì)OCR和AER的影響Fig.4 Effect of salinity on OCR and AER

3 討論

3.1 不同溫度下鹵蟲的窒息點(diǎn)變化

甲殼動(dòng)物的窒息點(diǎn)研究，多服務(wù)于經(jīng)濟(jì)甲殼類苗種運(yùn)輸，南美白對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)仔蝦、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)仔蝦和中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)各期幼體的窒息點(diǎn)均有研究。由于天然鹵蟲或較為粗放的鹵蟲養(yǎng)殖多是淺池養(yǎng)殖，養(yǎng)殖區(qū)域都在空曠的海灘、鹽湖、池沼，風(fēng)力增氧作用非常強(qiáng)，不易發(fā)生整體缺氧，但精養(yǎng)池水中氧氣消耗過(guò)大，代謝產(chǎn)物積累誘發(fā)的水質(zhì)惡化，可能會(huì)使孤雌生殖的鹵蟲向兩性生殖轉(zhuǎn)變，這將對(duì)以收獲鮮鹵蟲為主的養(yǎng)殖生產(chǎn)造成不利影響。研究表明，鹵蟲在20 ℃、25 ℃和30 ℃的窒息點(diǎn)分別為1.15 mg/L、1.32 mg/L和1.69 mg/L，窒息點(diǎn)與溫度呈現(xiàn)正相關(guān)，而且不同溫度組間差異顯著,顯示出與之前大多研究結(jié)果相同的規(guī)律，即：在生理適溫范圍內(nèi)，窒息點(diǎn)與溫度正相關(guān)?？梢酝普?，在鹵蟲養(yǎng)殖過(guò)程中，若遇高溫，需防低氧；在鹵蟲運(yùn)輸過(guò)程中，低溫運(yùn)輸能夠通過(guò)降低代謝而提高存活率，要安排好運(yùn)輸密度和運(yùn)輸時(shí)間。與其他相似體型的甲殼動(dòng)物相比，鹵蟲代謝高，自主運(yùn)動(dòng)能力差，沒有其他輔助的呼吸方式，更容易被風(fēng)吹到池塘一側(cè)，造成短時(shí)間密度過(guò)高，局部缺氧,迫近窒息點(diǎn)而大量死亡。

鹵蟲對(duì)低氧有一定的抵抗力，和大多數(shù)甲殼類一樣，其窒息點(diǎn)隨溫度的升高而增長(zhǎng)[15-16]，但鹵蟲屬于呼吸調(diào)節(jié)型生物還是呼吸適應(yīng)型生物需要進(jìn)一步研究。

3.2 光照對(duì)鹵蟲耗氧率和排氨率的影響

光照對(duì)水生生物的耗氧率和排氨率也有一定影響。在對(duì)海蜇(Rhopilemaesculenta)窒息點(diǎn)的研究中發(fā)現(xiàn)，受到“水呼吸”的影響，光照組比無(wú)光組耗氧更快[21]。光照對(duì)中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)稚蝦的消化生理研究中發(fā)現(xiàn)，光強(qiáng)比光色和光周期等參數(shù)影響更大[22]。光周期對(duì)鹵蟲的生長(zhǎng)無(wú)影響，但弱光(6 h/d)更有利于鹵蟲的存活[23]。

3.3 溫度對(duì)鹵蟲耗氧率和排氨率的影響

口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)的耗氧率隨季節(jié)溫度變化[24]。在12 ℃以下可低溫麻醉日本對(duì)蝦(Penaeusjaponicus)，即使操作處理也不會(huì)引起耗氧率升高[10]。在適宜的溫度范圍內(nèi)，鹵蟲的耗氧率、排氨率也隨溫度升高而上升(見圖3)。

作為外溫動(dòng)物，鹵蟲的特殊動(dòng)力作用較小(special dynamic action，SDA)。耗氧率、排氨率都反應(yīng)的是鹵蟲的總代謝情況，主要包括基礎(chǔ)代謝和活動(dòng)代謝兩部分。在適溫范圍內(nèi)，基礎(chǔ)代謝和活動(dòng)代謝提高，會(huì)導(dǎo)致耗氧率、排氨率提高；但接近生理上限的高溫，會(huì)降低活動(dòng)代謝并破壞基礎(chǔ)代謝。氨氮的毒性效應(yīng)，會(huì)在低溶氧、高溫時(shí)表現(xiàn)更為明顯，所以，在鹵蟲養(yǎng)殖過(guò)程中，要注意監(jiān)控水質(zhì)和密度，注意適時(shí)采收。由于變溫動(dòng)物的代謝水平隨溫度的升高而提高，故其耗氧多少與水溫高低呈正相關(guān)。另外，在實(shí)際生產(chǎn)中，水體溶解氧的飽和度隨水溫升高而降低，而水體中的化學(xué)耗氧量、養(yǎng)殖動(dòng)物和其它生物的生物耗氧量則隨溫度升高而增加。因此，在高溫季節(jié)應(yīng)經(jīng)常清理飼養(yǎng)環(huán)境、適當(dāng)降低放養(yǎng)密度；在運(yùn)輸鹵蟲活體時(shí)，應(yīng)盡量避開高溫天，控制數(shù)量，保障存活率。同類型研究采用的回歸方法各有不同，理論上講，耗氧率、排氨率與溫度的關(guān)系符合指數(shù)回歸，但選擇回歸系數(shù)更大的二項(xiàng)式回歸能更加精準(zhǔn)地反映變化趨勢(shì)，分別得出耗氧率和排氨率回歸方程為：OCR=-0.133 1x2+0.964 5x-0.190 4，R2=0.918 5；AER=-4.892 9x2+63.007x+26.3，R2=0.995 8。

3.4 鹽度對(duì)鹵蟲耗氧率和排氨率的影響

滲透壓的變化對(duì)廣鹽性生物的呼吸生理有著重要影響。V. Aarset等對(duì)極地的一種鉤蝦(Gammaruswilkitzkii)的代謝進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽度低時(shí)，需要增加能量供應(yīng)以進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)[9]。鹽度過(guò)高或過(guò)低會(huì)導(dǎo)致刀額新對(duì)蝦(Metapenaeusmonoceros)能耗增加，而在鹽度快速變化時(shí)這種趨勢(shì)尤為明顯[25]。日本對(duì)蝦(Penaeusjaponicus)溫度和鹽度對(duì)代謝交互作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著鹽度從15‰上升到25‰，耗氧率降低，繼續(xù)上升到35‰，則差異不顯著；在各個(gè)溫度組，鹽度從15‰上升25‰，再到35‰，排氨率都有所減少[10]?？梢姀V鹽性物種的耗氧率和排氨率與其調(diào)節(jié)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的程度密切相關(guān)，越是接近其常規(guī)生態(tài)環(huán)境的，耗能越小，反之亦然。除了鹽度的變化范圍，其變化速度也有一定影響，驟然變化，則會(huì)快速反饋，長(zhǎng)期馴化，可能變化不大。研究中選擇的3種鹽度的水，都來(lái)自于不同的鹵蟲養(yǎng)殖池，統(tǒng)計(jì)結(jié)果指出組間差異不顯著可能與其已經(jīng)適應(yīng)其所在的鹽度有關(guān)，而且鹵蟲適應(yīng)鹽度的能力較強(qiáng)，在設(shè)置組別時(shí)，應(yīng)該加大組距。盡管如此，在19.4%的高鹽度組，其耗氧率和排氨率的均值還是要高于其他兩組，根據(jù)結(jié)果推斷，鹵蟲養(yǎng)殖在鹽度較低的組別可能會(huì)獲得更高的產(chǎn)量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選取3種不同鹽度水體的鹵蟲，分別于常溫、常光下測(cè)定其耗氧率排氨率，高鹽度組(19.4%)的耗氧率和排氨率在數(shù)值上均大于中(16.0%)、低(14.0%)鹽度組，但差異不顯著,可能與鹵蟲具有良好的鹽度長(zhǎng)期適應(yīng)性和極強(qiáng)的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)能力相關(guān)。對(duì)于有一定鹽度適應(yīng)性的生物，要正確把握耗氧率與鹽度變化的關(guān)系就必須在實(shí)驗(yàn)前給予動(dòng)物足夠的馴化時(shí)間，并了解動(dòng)物移入呼吸器后耗氧率的時(shí)間變化。相比鹽度馴化，鹽度的驟變可能更能引起甲殼類的呼吸、排泄變化。