羅竹，楊欣 馮俐 李亞輝 呂潤霖 韓彩瑤 鄧萬娟 李專 張鵬飛

【摘?要】?目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理明確天麻素發(fā)揮藥理作用的分子機(jī)制。方法：天麻素化學(xué)結(jié)構(gòu)基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional?Chinese?Medicine?Systems?Pharmacology，TCMSP）下載，靶標(biāo)蛋白篩選基于SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫，基于DAVID數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)進(jìn)行生物過程（biological?process，BP）、細(xì)胞成分（cellular?component，CC）以及分子功能（molecular?function，MF）進(jìn)行分析，100個靶標(biāo)通過STRING進(jìn)行相互作用分析，?基于Cytoscape?3.5.1中的Cytohubba模塊篩選出關(guān)鍵基因。結(jié)果：天麻素篩選出100個靶點(diǎn)，共參與102條通路（P<0.05）;主要參與one-carbon?metabolic?process（碳代謝過程）、response?to?drug（藥物反應(yīng)）、proteolysis（蛋白水解）等生物過程;主要存在plasma?membrane（質(zhì)膜）、melanosome（黑素體）、dendrite?cytoplasm（樹突細(xì)胞質(zhì)）等細(xì)胞成分;分子功能上，100個靶點(diǎn)主要有insulin?receptor?substrate?binding（胰島素受體底物結(jié)合）、phosphatidylinositol?3-kinase?binding（磷脂酰肌醇3-激酶結(jié)合）等，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（?glyceraldehyde-3-phosphate?dehydrogenase，GAPDH?）為關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過分子對接明確天麻素與GAPDH有較強(qiáng)的結(jié)合活性（Total-Score=7.5）。結(jié)論：初步明確天麻素調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)，為動物、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】?天麻素;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);通路分析;功能分析

【中圖分類號】R966?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】?A【文章編號】1007-8517（2019）21-0026-06

Screening?Molecular?Mechanisms?of?Gastrodin?in?Prevention?and?Treatment?of

Diabetes?Mellitus?base?on?Network?Pharmacology

LUO?Zhu??YANG?Xin*?FENG?Li?Li?Yahui?LV?Runlin?HAN?Caiyao?DENG?Wanjuan?LI?Zhuan?ZHANG?Pengfei

Guizhou?University?of?Traditional?Chinese?medicine，??Guiyang??550025，China

Abstract：Objective?To?screen?the?molecular?mechanism?of?Gastrodin?in?pharmacological?action?based?on?network?pharmacology.?Methods?Chemical?structure?of??Gastrodin?based?on?TCMSP?download，?Screening?of?target?proteins?based?on?SwissTarget?Prediction?database，?biological?process，?cellular?component?and?molecular?function?of?target?based?on?DAVID?database，?100?targets?were?analyzed?by?STRING?and?key?genes?were?screened?based?on?Cytohubba?in?Cytoscape?3.5.1.?Results?Gastrodin?screened?out?100?targets?and?participated?in?102?pathways?（P<0.05），?There?are?mainly?plasma?membrane，?melanosome，?dendrite?cytoplasm?and?other?cellular?components;?insulin?receptor?substrate?binding，?phosphatidylinositol?3-kinase?binding?etc;?In?molecular?function，?100?targets?are?mainly?involved?in?participate?in?biological?processes?such?as?one-carbon?metabolic?process，?response?to?drug，?proteolysis?etc;?GAPDH，?CASP3，?MAPK1?and?MGAM?are?key?targets.The?binding?activity?of?gastrodin?to?GAPDH?was?confirmed?by?molecular?docking（Total-Score=7.5）.?Conclusion?The?target?of?gastrodin?regulation?was?preliminarily?identified?to?provide?theoretical?basis?for?animal?and?cell?experiments.

Keywords：Gastrodin;?Network?Pharmacology;?Pathway?Analysis;?Functional?Analysis

天麻（Gastrodia?elata?BL.）?為貴州道地藥材，是常用而較名貴的中藥材，臨床應(yīng)用廣泛，在頭痛眩暈、癲癇、小兒驚風(fēng)等方面發(fā)揮重要作用[1]。主要含有：香莢蘭醇、香莢蘭醛、天麻素、多糖等化學(xué)成分，其中天麻素（gastrodin）含量最高[2]。天麻素藥理作用廣泛，毒副作用較，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，天麻素在心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)疼痛、帕金森病等有較好的治療效果[3-4]。已經(jīng)有文獻(xiàn)表明：天麻素注射液、天麻素聯(lián)合丹紅注射液、天麻醇提物、乙酰天麻素等在糖尿病及其并發(fā)癥中發(fā)揮作用[5-6]，但是作用機(jī)制尚未明確，為了進(jìn)一步明確天麻素防治糖尿病調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理方法，篩選天麻素作用的靶點(diǎn)，對其靶點(diǎn)進(jìn)行通路分析、GO（Gene?Ontology）功能注釋、相互作用分析等，明確天麻素防治糖尿病的分子機(jī)制。

1?材料與方法

1.1?數(shù)據(jù)庫與軟件?STRING（https：//stringdb.org/）;DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）;?Cytoscape?3.5.1軟件（http：//www.cytoscape.org）;KOBAS3.0（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php）;軟件運(yùn)行于?Windows?操作系統(tǒng)平臺下，使用的相關(guān)軟件已授權(quán)或開源軟件。

1.2?天麻素靶標(biāo)蛋白篩選?天麻素的mol2結(jié)構(gòu)基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional?Chinese?Medicine?Systems?Pharmacology?，TCMSP）[7]下載，采用SYBYL對薏苡仁化合物加氫、加電荷，每個化合物進(jìn)行能量優(yōu)化。采用靶標(biāo)蛋白篩選基于Swiss?Target?Prediction（http：//www.swisstarge-tprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫，根據(jù)化學(xué)成分的2D?和?3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測?？梢灶A(yù)測五種不同來源的生物，基于Daylight?FP2的分子指紋方法，并采用了Tanimoto系數(shù)定義的相似度度量方法。通過Swiss?Target?Prediction進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測，在線打開Swiss?Target?Prediction，在Choose?an?organism一欄中選擇Homo?sapiens。輸入天麻素化學(xué)成分的SMILES，篩選天麻素靶標(biāo)蛋白。

1.3?天麻素靶標(biāo)蛋白生物功能分析?靶點(diǎn)GO功能分析基于DAVID?6.8（DAVID?6.8，https：//david.?ncifcrf.gov/）在線分析，將100個靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，點(diǎn)擊限定物種為人源，設(shè)定閾值P<0.01，GO注釋分析包含，即細(xì)胞組分（cellular?component，CC）、生物過程（biological?process，BP）以及分子功能（molecular?function，MF）。

1.4?天麻素靶標(biāo)蛋白靶標(biāo)通路分析及ggplot?2構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型?基于KOBAX3.0（KEGG?Orthology?Based?Annotation?System）對天麻素靶標(biāo)蛋白進(jìn)行通路富集分析，共有表達(dá)差異基因通過數(shù)據(jù)庫整合到相應(yīng)的Pathway條目。結(jié)果得到靶標(biāo)蛋白參與的所有途徑，篩選靶標(biāo)蛋白顯著參與的途徑（P≤0.01），通過Rstudio中的ggplot?2輸出top?20通路，顯示通路名稱、Rich?factor、富集分析的P值和Q值等。

1.5?靶標(biāo)蛋白相互作用分析?基于STRING對天麻素靶標(biāo)蛋白進(jìn)行相互作用分析，物種設(shè)為“Homo?sapiens”（人源），下載string_?interactions.tsv文件，導(dǎo)入Cytoscape?3.5.1軟件，基于?Cytoscape?3.5.1?軟件中的的Cytohubba模塊篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)[8-9]。

1.6?分子對接及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)?采用Surflex-Dock?模塊完成分子對接研究[10]。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（1U8F）從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫RCSB??（http：//www.rcsb.org/pdb?）?獲取?3D?晶體結(jié)構(gòu)[11]?；赟urflex-Dock?模塊完成分子對接研究（標(biāo)準(zhǔn)模式）。選擇配體（Ligand）模式產(chǎn)生活性口袋;其他參數(shù)均采用?SYBYL默認(rèn)值，篩選結(jié)果以Total-Score>5為閾值[12]?；贚igplot?對天麻素和GAPDH進(jìn)行相互作用分析。

2?結(jié)果

2.1?天麻素靶點(diǎn)GO功能注釋分析?基于DAVID對天麻素靶點(diǎn)進(jìn)行GO注釋分析（表1），生物過程中，100個靶點(diǎn)主要參與one-carbon?metabolic?process（碳代謝過程）、response?to?drug（藥物反應(yīng)）、proteolysis（蛋白水解）;主要存在plasma?membrane（質(zhì)膜）、melanosome（黑素體）、dendrite?cytoplasm（樹突細(xì)胞質(zhì)）等;分子功能上，100個靶點(diǎn)主要有insulin?receptor?substrate?binding（胰島素受體底物結(jié)合）、phosphatidylinositol?3-kinase?binding（磷脂酰肌醇3-激酶結(jié)合）等分子功能。

2.2?天麻素靶標(biāo)蛋白通路分析?采用DAVID?數(shù)據(jù)庫對天麻素靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，100個靶標(biāo)蛋白顯著參與102條通路途徑（P<0.05），采用R語言的ggplot?2輸出20條通路（圖1），其中包括胰島素信號通路（Insulin?signaling?pathway）、TNF信號通路、胰島素抵抗等，詳見表2。

2.3?天麻素靶標(biāo)蛋白相互作用分析?基于Cytoscape?3.5.1中的Cytohubba模塊，對100個靶標(biāo)基因進(jìn)行相互作用分析，根據(jù)degree（度）的大小，輸出前30個靶標(biāo)基因（表3），顏色越深，靶點(diǎn)越重要。100個靶標(biāo)蛋白中GAPDH為最關(guān)鍵靶點(diǎn)。

通過靶點(diǎn)相互作用分析，發(fā)現(xiàn)GAPDH為核心靶點(diǎn)，將采用分子對接進(jìn)一步研究。天麻素與GAPDH形成4個氫鍵：Asp?35，Arg?16，Thr?99，Ser?122;天麻素與氨基酸Phe?37，Ser?98，Gly?100，Ile?14，Gly?12，Pro?191和Ile?38形成疏水作用（圖2）。

2.4?分子對接及氨基酸位點(diǎn)分析?利用?Surflex-Dock?分子對接模塊的?Total-Score?打分函數(shù)對小分子與靶標(biāo)蛋白相互作用進(jìn)行評分，Total-Score值愈大，說明小分子化合物與大分子蛋白質(zhì)的匹配結(jié)合作用越好。天麻素與GAPDH分子對接結(jié)果為Total-Score=7.5，進(jìn)一步驗(yàn)證靶點(diǎn)相互作用的結(jié)果。說明天素與GAPDH有較強(qiáng)列的結(jié)合。

3?討論

天麻素藥理作用廣泛，具有較好的應(yīng)用前景[13]。已經(jīng)文獻(xiàn)[14-15]表明：天麻素在腦缺血再灌注損傷、短暫性腦缺血、眩暈癥等多種疾病中發(fā)揮較好的治療效果。通過分子對接發(fā)現(xiàn)天麻素與甘油醛-3-磷酸脫氫酶（?glyceraldehyde-3-phosphate?dehydrogenase，?GAPDH?）有較好的結(jié)合（Total-Score=7.5），GAPDH參與能量代謝，同時也具有其他生理功能，與糖尿病密切相關(guān)。GAPDH在多種組織和細(xì)胞中表達(dá)。Min等[16]研究表明：GAPDH通過激活磷酸酶的活性對胰島素通路具有調(diào)節(jié)作用;同時由于糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變、血管內(nèi)皮組織的損傷等并發(fā)癥的發(fā)生與GAPDH關(guān)系密切。GAPDH為多功能蛋白，目前，對機(jī)體的生理和病理狀態(tài)下的作用值得深入的研究。對于開發(fā)GAPDH的抑制劑和誘導(dǎo)劑有較好的應(yīng)用前景，尤其是GAPDH與胰島素通路關(guān)系密切，為糖尿病的防治提供一個嶄新的藥理靶向。

已有文獻(xiàn)[17]證實(shí)天麻素具有防治糖尿病的作用。白永等人通過免疫組化、蛋白印記、PCR等技術(shù)明確天麻素可以降低胰島素抵抗的同型半胱氨酸的含量;Sun等[18]觀察天麻素對STZ誘導(dǎo)痛性糖尿病神經(jīng)病變（PDN）的實(shí)驗(yàn)動物模型的作用。對糖尿病引起的瞬態(tài)鈉電流、鉀電流有一定的對抗作用。目前，天麻素作用的靶點(diǎn)尚未完全明確，本研究通過分子對接發(fā)現(xiàn)GAPDH為天麻素核心靶點(diǎn)，通過分子對接發(fā)現(xiàn)天麻素與GAPDH有較好的結(jié)合。而且明確Phe37、Ser98、Gly100、Ile14、Gly12、Pro191、Ile38為關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)?？梢酝茰y這些殘基就是?GAPDH的重要?dú)埢湓跊Q定酶的催化特性中起到了重要作用。

基于DAVID對天麻素調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)進(jìn)行通路分析，包括胰島素信號通路、TNF信號通路、胰島素抵抗等與糖尿病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的通路。目前，天麻素藥理作用的研究尚未全面、系統(tǒng)的分析，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選天麻素調(diào)節(jié)的靶標(biāo)蛋白，對靶標(biāo)蛋白進(jìn)行功能分析、通路分析、蛋白相互作用分析，最后采用分子對接技術(shù)驗(yàn)證天麻素與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合，明確其發(fā)揮藥理作用的分子機(jī)制，從而為天麻素的應(yīng)用及天麻制劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-08-14?編輯：程鵬飛）