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      細(xì)葉石仙桃乙醇提取物自由基清除活性研究

      2019-01-17 12:26:12,,,*,,
      山東化工 2018年24期
      關(guān)鍵詞:細(xì)葉仙桃清除率

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      (1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,廣西 南寧 530001;2.廣西南寧市第五十六中學(xué),廣西 南寧 530001;3.廣西師范學(xué)院化學(xué)與材料學(xué)院,廣西 南寧 530001 .)

      細(xì)葉石仙桃(Pholidota cantonensis Rolfe)是蘭科石仙桃屬植物,根狀莖匍匐,分枝,直徑2.5~3.5nm,密被鱗片狀鞘,通常相距1-3厘米生假鱗莖,節(jié)上疏生根;假鱗莖狹卵形至卵狀長(zhǎng)圓形,長(zhǎng)1~2cm,寬5~8nm,基部略收狹成幼嫩時(shí)為籜狀鱗片所包,頂端生2葉?;ㄆ?月,果期8-9月。產(chǎn)浙江、江西、福建、臺(tái)灣、湖南、廣東和廣西。生于林中或蔭蔽處的巖石上,海拔200~850m。《滇藥錄》:全草(假鱗莖)治瘡癤紅腫疼痛,火灼傷?!兑退幹尽啡葜喂钦?,關(guān)節(jié)脫位。人體新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量自由基,與動(dòng)脈硬化、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、肌肉萎縮和老年癡呆等多種疾病相關(guān)[1-3]。由于合成的抗氧化劑副作用多,近年來(lái)科研工作者致力于尋找來(lái)源于植物的天然抗氧化劑[4-5]。細(xì)葉石仙桃作為一種常用的草藥,其抗氧化方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)冷浸法得到細(xì)葉石仙桃乙醇提取物,采用DPPH和羥自由基體系,評(píng)估其對(duì)自由基清除能力。

      1 材料與儀器

      UV1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析電子科技有限公司)。細(xì)葉石仙桃藥材購(gòu)于廣西百色。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于百靈威試劑公司(北京)。所有試劑均為分析純。

      2 方法

      2.1 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物制備

      稱取20 g細(xì)葉石仙桃粉末,加入200 mL乙醇(95%),冷浸72 h。重復(fù)上述操作3次,合并提取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑,得到細(xì)葉石仙桃乙醇提取物。

      2.2 總黃酮含量測(cè)定

      2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

      精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液(l mg/mL)于l0 mL量瓶中,分別加5%亞硝酸鈉0.4 mL,靜置6min,加入5%硝酸鋁0.4mL,靜置6min。加5%氫氧化鈉試液4.0 mL,用95%乙醇稀釋至刻度,搖勻。靜置15min,在510nm處測(cè)定吸收度。以吸收度對(duì)溶液濃度進(jìn)行回歸分析,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,推出回歸方程。

      2.2.2 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物總黃酮含量測(cè)定

      將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液換為固定濃度提取物溶液,同上操作測(cè)定吸光度,多次測(cè)量求平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的蘆丁當(dāng)量,總黃酮含量以每克干物質(zhì)的蘆丁當(dāng)量(mg)表示,并計(jì)算提取得率。

      2.3 二苯基苦味肼基自由基(DPPH)體系[4]

      取不同濃度細(xì)葉石仙桃乙醇提取物提取物溶液(0.2、0.5、0.8、1.2、1.5、1.8和2.0 mg/mL)加入8 mL DPPH(0.004%)溶液中。在最大波長(zhǎng)處(517 nm)測(cè)吸光度,直到平衡為止。清除率計(jì)算公式如下:S % = (1-A樣品)/ A空白 × 100%。其中,A空白為未加藥液的DPPH溶液的吸光度,A樣品為加入藥液的DPPH溶液的吸光度。

      2.4 羥自由基體系

      以蒸餾水將75 mmo1/L鄰二氮菲無(wú)水乙醉溶液稀釋至7.5 mmol/L,依次往50 mL比色管中加入1.0 mL濃度7.5 mmol/L鄰二氮菲溶液,5 mL pH7.4 PBS,1.0 mL FeSO4溶液,一定量的抗氧劑溶液,1.0 mL H2O2應(yīng)用液,以蒸餾水補(bǔ)充體積至25 mL。37 ℃保溫反應(yīng)60 min,測(cè)A510。既加抗氧劑,又加H2O2的為加藥管;不加抗氧劑,只加H2O2的為損傷管;未損傷管兩者均不加。羥自由基清除率s=[A加藥-A損傷)]/[A未損傷-A損傷]×100%。若為負(fù)值,則表示此時(shí)表現(xiàn)促氧化性;若為正值,則表示此時(shí)表現(xiàn)抗氧化性。

      3 結(jié)果

      3.1 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

      以吸收度對(duì)溶液濃度進(jìn)行回歸分析,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,推出回歸方程為:y=9.6778x+0.0167(R=0.9992)。根據(jù)線性方程得出細(xì)葉石仙桃乙醇提取物的總黃酮含量測(cè)定結(jié)果,其總黃酮含量為39.6 mg/g。細(xì)葉石仙桃乙醇提取物具有較高的總黃酮含量。

      3.2 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

      3.2.1 不同濃度提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

      圖1為不同濃度細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力。藥液濃度為0.2 mg/mL時(shí),提取物對(duì)DPPH自由基的清除率為24.8%。藥液濃度為0.5和0.8 mg/mL時(shí),提取物對(duì)DPPH自由基的清除率分別為48.7%和61.5%,分別為0.2 mg/mL時(shí)清除率的1.96和2.48倍。藥液濃度為1.8和2.0時(shí),提取物對(duì)DPPH自由基的清除率分別為81.6%和83.7%,分別為0.2 mg/mL時(shí)清除率的3.29和3.38倍,表明隨著藥液濃度增加,提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力迅速增大。

      圖1 不同濃度細(xì)葉石仙桃乙醇提取物 對(duì)DPPH自由基的清除能力

      3.2.2 不同時(shí)間提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

      圖2 不同時(shí)間細(xì)葉石仙桃乙醇提取物 對(duì)DPPH自由基的清除能力(濃度=2.0 mg/mL)

      圖2列出了不同時(shí)間細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除率。隨著反應(yīng)時(shí)間增加,細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力增大。將濃度為2.0 mg/mL的提取物加入DPPH自由基時(shí)測(cè)得DPPH自由基清除率為58.9%,10 min后測(cè)得清除率增大至1.27倍,為74.7%。從圖2可以看出,反應(yīng)時(shí)間20 min后,DPPH自由基清除率增加較為平緩,反應(yīng)時(shí)間為70 min時(shí)的清除率為20 min時(shí)清除率的1.07倍。

      3.3 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)羥基自由基的清除能力

      圖3表示的是細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)羥基自由基的清除能力。隨著濃度增加,細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)羥自由基的清除能力迅速增大。濃度為0.2 mg/mL時(shí)該提取物對(duì)羥自由基的清除率為19.7%,濃度為0.5和0.8 mg/mL時(shí),羥自由基清除率分別增加至1.30和2.09倍,分別為25.6%和41.2%。值得注意的是,濃度為2.0 mg/mL時(shí),羥自由基清除率達(dá)到了100%。

      圖3 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物 對(duì)羥基自由基的清除能力

      3.4 細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH和羥基自由基的EC50值

      細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的EC50值為0.52 mg/mL,對(duì)羥自由基的EC50值為0.98 mg/mL。EC50的數(shù)值越大,表明抗氧化劑對(duì)自由基的清除能力越強(qiáng)。細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH和羥基自由基較低的EC50值表明其對(duì)DPPH和羥基自由基具有良好的清除能力,這可能與其較高含量的黃酮類物質(zhì)有關(guān)。

      4 結(jié)論

      本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了細(xì)葉石仙桃乙醇提取物的總黃酮含量,并采用DPPH自由基體系和羥自由基體系來(lái)評(píng)估其自由基清除活性。結(jié)果表明,細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH自由基顯示出良好的清除效果,濃度為2.0 mg/mL時(shí)清除率為83.7%。同時(shí),該提取物對(duì)羥自由基具有優(yōu)異的清除能力,清除率最高達(dá)到了100%。細(xì)葉石仙桃乙醇提取物對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除率與藥液濃度呈正相關(guān)性,而該提取物對(duì)DPPH自由基清除率也與反應(yīng)時(shí)間有關(guān)。細(xì)葉石仙桃乙醇提取物具有優(yōu)異的自由基清除能力,有望作為天然的自由基清除劑應(yīng)用。

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