于佳龍，黃南渠，施尚鵬，李 航,劉華慶，羅 勇

(1.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 急診科，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 藥物臨床試驗機構(gòu)，貴州，遵義 563000；3.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科，貴州 遵義 563000；4.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099；5.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，約占原發(fā)性腦腫瘤的60%以上，據(jù)統(tǒng)計，中國腦膠質(zhì)瘤年發(fā)病率為3～6人/10萬人，年死亡人數(shù)達(dá)3萬人[1-2]，腦膠質(zhì)瘤傳統(tǒng)上被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)按惡性程度劃分為4個等級，表示為I至IV，其中I、II型為低級別腦膠質(zhì)瘤，III、IV型為高級別腦膠質(zhì)瘤[3]。因其發(fā)病機制復(fù)雜，而現(xiàn)有的手術(shù)及替莫唑胺等藥物輔助治療效果欠佳[4]，因此對腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制及進(jìn)一步治療方案的研究成為重點。

近年來，隨著基因組學(xué)的蓬勃發(fā)展，腦膠質(zhì)瘤的諸多分子標(biāo)志物相繼被發(fā)現(xiàn)，有研究顯示異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenase,IDH)突變與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系較為密切。Parsons等2008年在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的外顯子組測序中發(fā)現(xiàn)超過20%的腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)了IDH1基因在第132位的精氨酸(R)轉(zhuǎn)換為組氨酸(H)，隨著對IDH的深入研究，Hartmann等在2009年發(fā)現(xiàn)IDH1 R132H基因突變?yōu)槟X膠質(zhì)瘤中的最常見的基因突變[5-6]，學(xué)者在惡性腫瘤的癌前病變中發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的過度表達(dá)，其中乳腺癌中最為明顯[7]。秦華平等[8]通過用SABC免疫組化法證明HIF-1α蛋白在膠質(zhì)瘤中明顯表達(dá)。相關(guān)實驗結(jié)果表明，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)為腦膠質(zhì)瘤血管生成的重要環(huán)節(jié)，且腦膠質(zhì)瘤中的VEGF均高表達(dá)(正常腦組織幾乎不表達(dá))，參與著腦膠質(zhì)瘤的血管生成及侵襲過程[9-10]。目前僅偶見有關(guān)于三者在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及相關(guān)機制的研究。因此，本研究擬選取51例腦膠質(zhì)瘤患者石蠟切片及10例非膠質(zhì)瘤正常腦組織的存檔石蠟切片，通過免疫組織化學(xué)法檢測IDH1 R132H、HIF-1α及VEGF的表達(dá)，研究三者的表達(dá)情況及與臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取2007年1月～2017年12月遵義市第一人民醫(yī)院、遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、貴州航天醫(yī)院3家醫(yī)院的51例腦膠質(zhì)瘤手術(shù)切除標(biāo)本的石蠟切片及10例正常腦組織切片(交通事故尸體解剖后保留的腦組織)，每個組織切4張切片。所有病理切片經(jīng)HE染色后重新按照腦膠質(zhì)瘤2016 WHO分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級[3]。其中I級13例，II級17例，III級14例，IV級7例?；颊咝g(shù)前均未行放化療治療，且均為首發(fā)病例。男性26例，女性25例。年齡分組[11]：<45歲(青年組)28例，45～59歲(中年組)14例，≥60歲(老年組)9例。腫瘤部位：額葉14例，顳葉13例，枕葉6例，頂葉5例，其他部位13例。

1.2 實驗試劑 即用型一抗：兔抗人HIF-1α單克隆抗體、兔抗人VEGF-A多克隆抗體及小鼠抗人IDH1(R132H)單克隆抗體(一抗工作濃度均為1∶100)。二抗：HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物、增強劑、抗原修復(fù)液、PBS、防脫玻片、免疫組化筆均購于北京中杉金橋生物公司。

1.3 實驗方法 將存檔的51例腦膠質(zhì)瘤患者及10例正常腦組織的石蠟標(biāo)本進(jìn)行切片，切片厚度為4 μm，然后進(jìn)行免疫組化PV-9000(Polink-2 plus)二步法染色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。其中IDH1 R132H 用已有的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本作陽性對照，HIF-1α用乳腺癌組織作陽性對照，VEGF用肝癌組織作陽性對照。組織抗原均采用高溫修復(fù)(微波爐中火加熱12 min)，上述操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.4 結(jié)果判讀 IDH1R132H及HIF-1α主要表達(dá)在細(xì)胞核，VEGF蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，3個指標(biāo)的陽性信號主要表現(xiàn)為棕黃色或褐色染色，由2名病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片，依照陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行判定，在5個高倍鏡視野下(10×40倍)將無陽性細(xì)胞數(shù)或陽性細(xì)胞數(shù)<1%定性為陰性，將陽性細(xì)胞>1%定性為陽性[12]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用例(百分比)表示，無序分類變量用χ2檢驗，等級資料用秩和檢驗，組間關(guān)聯(lián)性分析用行×列表χ2檢驗做關(guān)聯(lián)性分析，檢驗水準(zhǔn)均取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組與對照組的臨床資料及目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況 HIF-1α表達(dá)方面：對照組10例均陰性，腫瘤組27例陰性表達(dá)，24例陽性表達(dá)，經(jīng)分析存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。VEGF表達(dá)方面：對照組10例均陰性，腫瘤組20例陰性表達(dá)，31例陽性表達(dá)，經(jīng)分析存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。而IDH1R132H方面：對照組10例均陰性，腫瘤組陰性表達(dá)30例，陽性表達(dá)21例，經(jīng)分析存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05,見表1、圖1～2)。

表1腦膠質(zhì)瘤組與對照組的基本情況比較

指標(biāo)對照組例數(shù)%腫瘤組例數(shù)%χ2/ZP性別0.4030.525 男440.002650.98 女660.002549.02年齡分組0.3570.837 <45歲660.002854.90 45^59歲330.001427.45 ≥60歲110.00917.65分級43.032<0.001 正常腦組織10100.0000.00 I級00.001121.57 II級00.002039.22 III級00.001427.45 IV級00.00611.76IDH1R132H 6.2790.012 陰性10100.003058.82 陽性00.002141.18HIF-1α 7.7580.005 陰性10100.002752.94 陽性00.002447.06VEGF 12.329<0.001 陰性10100.002039.22 陽性00.003160.78三個指標(biāo)2.0700.150 均陰性10100.004282.35 均陽性00.00917.65

A：IDH1 R132H在腦膠質(zhì)瘤中的陽性表達(dá)(陽性對照)； B：HIF-1α在乳腺癌中的陽性表達(dá)(陽性對照)； C：VEGF在肝癌中的陽性表達(dá)(陽性對照)； D：IDH1R132H在正常腦組織中的陰性表達(dá)(陰性對照)； E： HIF-1α在正常腦組織中的陰性表達(dá)(陰性對照)； F： VEGF在正常腦組織中的陰性表達(dá)(陰性對照)。圖1 IDH1 R132H、HIF-1α及VEGF的陽性對照及正常腦組織陰性對照(×400)

A： IDH1 R132H 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞核上陽性表達(dá)； B： HIF -1α 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞核的陽性表達(dá)； C：HIF -1α在膠質(zhì)瘤細(xì)胞核的陽性表達(dá)； D： VEGF 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞質(zhì)中的陽性表達(dá)。圖2 IDH1 R132H、HIF-1α及VEGF在腦膠質(zhì)瘤中的陽性表達(dá)(×400)

2.2 不同病理特征腦膠質(zhì)瘤的IDH1 R132H、HIF-1α及VEGF的表達(dá) IDH1R132H陽性表達(dá)21例，組織分級中：III級表達(dá)最高57.14%(8/14)，II級表達(dá)次之50.00%(10/20)，IV級表達(dá)最低0(0/6)；性別分組中：男性陽性表達(dá)較高50%(13/26)，女性陽性表達(dá)率為32%(8/25)；在年齡分組中：中年組(45～59歲)表達(dá)最高57.14%(8/14)，老年組表達(dá)最低33.33%(3/9)；在位置分組中：頂葉表達(dá)最高80%(4/5)，額葉表達(dá)最低(3/14)；經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，IDH1R132H蛋白的表達(dá)與性別、年齡、組織分級及位置無關(guān)(P>0.05)。HIF-1α陽性表達(dá)有24例，組織分級中：IV級表達(dá)最高83.33%(5/6)，II級表達(dá)最低35.00%(7/20)；性別分組中：男性陽性表達(dá)較高53.85%(14/26)，女性陽性表達(dá)率為40.00%(10/25)；年齡分組中：老年組表達(dá)最高77.8%(7/9)，青年組表達(dá)最低32.14%(9/28)；位置分組中：顳葉表達(dá)較高50.00%(3/6)，額葉表達(dá)最低21.42%(3/14)；經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，年齡分組中中年及老年差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HIF-1α的陽性表達(dá)與性別、組織分級及位置無關(guān)(P>0.05)。VEGF表達(dá)陽性有31例，在組織分級中：I級表達(dá)最高72.73%(8/11)，IV級表達(dá)最低50.00%(3/6)；性別分組中：女性陽性表達(dá)較高64.00%(16/25)，男性陽性表達(dá)率為57.69%(51/26)；年齡分組中：老年組表達(dá)最高66.67%(6/9)，中年組表達(dá)最低57.14%(8/14)；在位置分組中：顳葉表達(dá)較高76.92%(10/13)，枕葉表達(dá)最低16.67%(1/6)；經(jīng)分析，VEGF在膠質(zhì)瘤的位置分組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；VEGF陽性表達(dá)與性別、年齡、組織分級無關(guān)(P<0.05，見表2)。

表2 IDH1R132H、HIF-1α及VEGF陽性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

指標(biāo)例數(shù)IDH1R132H陽性(%)χ2PHIF-1α陽性(%)χ2PVEGF陽性(%)χ2P三陽性陽性(%)χ2P性別男2613(50.00)1.710.19214(53.85)0.980.32215(57.69)0.210.6457(26.9)3.140.076女258(32.00)10(40.00)16(64.00)2(8.00)年齡<45歲2810(35.71)2.0470.3599(32.14)6.4810.03917(60.71)0.2090.9013(10.71)2.1780.33745^59歲148(57.14)8(57.14)?8(57.14)4(28.57)≥60歲93(33.33)7(77.78)6(66.67)2(22.22)分級I級113(27.27)7.050.0695(45.45)0.8060.8488(72.73)1.280.7340(0)4.9370.154II級2010(50.00)7(35.00)11(55.00)5(25.00)III級148(57.14)7(50.00)9(64.29)4(28.57)IV級60(0.00)5(83.33)3(50.00)0(0)位置額葉143(21.42)5.7310.2213(21.42)6.6180.1587(50.00)11.0060.0261(7.14)4.1720.390顳葉136(46.15)7(53.85)10(76.92)3(23.08)枕葉63(50.00)3(50.00)1(16.67)##0(0)頂葉54(80.00)2(40.00)2(40.00)1(20.00)其他部位135(38.46)9(69.23)11(84.62)4(30.77)

*：45～59歲與≥60歲，P<0.05；##：枕葉與其它位置相比，P<0.01。

2.3 IDH1R132H、VEGF及HIF-1α 3個指標(biāo)之間兩兩比較的相關(guān)性分析 51例腦膠質(zhì)瘤中，VEGF蛋白陽性表達(dá)率為60.78%(31/51)，HIF-1α蛋白陽性表達(dá)率為47.06 %(24/51)；VEGF、HIF-1α蛋白均陽性者18例，均陰性者14例，VEGF蛋白陽性且HIF-1α蛋白陰性者13例，VEGF蛋白陰性且HIF-1α蛋白陽性者6例，VEGF與HIF-1α蛋白表達(dá)呈正關(guān)聯(lián)，關(guān)聯(lián)強度：1.67 (χ2=3.84，P=0.05)，95%CI：[1.00，2.76](見表3)。IDH1R132H蛋白陽性表達(dá)率為41.18%(21/51)，HIF-1α蛋白陽性表達(dá)率為47.06%(24/51)；IDH1R132H、HIF-1α蛋白均陽性者10例，均陰性者16例，IDH1R132H蛋白陽性且HIF-1α蛋白陰性者11例，IDH1 R132H蛋白陰性且HIF-1α蛋白陽性者14例，IDH1R132H與HIF-1α蛋白表達(dá)無明顯關(guān)系， (χ2=0.004，P=0.948，見表4)。VEGF蛋白陽性表達(dá)率為60.78%(31/51)，IDH蛋白陽性表達(dá)率為41.18%(21/51)；VEGF、IDH1R132H蛋白均陽性者15例，均陰性者14例，VEGF蛋白陽性且HIF蛋白陰性者16例，VEGF蛋白陰性且HIF-1α蛋白陽性者6例，IDH1R132H與HIF-1α蛋白表達(dá)無明顯關(guān)聯(lián)(χ2=1.697，P=0.183，見表5)。

表3 VEGF、HIF-1α蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性分析(n=51)

VEGFHIF+-合計+181331-61420

表4 IDH1R132H、HIF-1α蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性分析(n=51)

IDH1R132HHIF+-合計+101121-141630

表5 IDH1R132H、VEGF蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性分析(n=51)

VEGFIDH1R132H+-合計+151631-61420

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤，目前被認(rèn)為是顱內(nèi)原發(fā)腫瘤發(fā)病率最高的，根據(jù)美國腫瘤注冊中心(central brain tumor registry of the united states,CBTRUS)統(tǒng)計，膠質(zhì)瘤占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的27%，占惡性腫瘤的80%[3]，因其較高的致死率及致殘率，目前對其研究越來越多。

生物體內(nèi)的IDH1(NADP-依賴型IDH)可催化異檸檬酸的氧化脫羧生成α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)，當(dāng)該基因發(fā)生突變時，會產(chǎn)生大量的2-羥基戊二酸(2-hydroxyglutaric,2-HG)堆積， 2-HG的堆積大量消耗2-羥基戊二酸脫氫酶。2-HG大量堆積可以影響大腦內(nèi)白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能，導(dǎo)致腦內(nèi)白質(zhì)病變，同時2-HG抑制腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的形成，產(chǎn)生高水平的HIF-1α，促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲，最終這些改變將導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展[13-14]。HIF-1α對維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、血管生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移起重要作用[15]。膠質(zhì)瘤的特征是快速失控的生長導(dǎo)致缺氧區(qū)域和壞死[16]。這也為HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)提供條件，進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不斷增生。

李金磊等[17]通過實驗證實HIF-1α在高級別膠質(zhì)瘤中表達(dá)高于低級別膠質(zhì)瘤，即HIF-1α的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性程度成正相關(guān)，可以作為判斷腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的指標(biāo)。而謝燕等[18]對135例膠質(zhì)瘤組織切片進(jìn)行實驗并得出HIF-1α的表達(dá)與預(yù)后呈正相關(guān)，同時與性別、部位無相關(guān)性。而本實驗發(fā)現(xiàn)，HIF-1α的表達(dá)與年齡有關(guān)，老年人的表達(dá)明顯最高，青年表達(dá)最低(P<0.05)，且高級別膠質(zhì)瘤的表達(dá)高于低級別膠質(zhì)瘤，提示年紀(jì)越大，HIF-1α表達(dá)越高，惡性程度越高，預(yù)后越差。同時我們實驗發(fā)現(xiàn)HIF-1α與VEGF呈正關(guān)聯(lián)?？赡艿臋C制為HIF-1α表達(dá)增加，可促進(jìn)VEGF mRNA的表達(dá)，增加VEGF的表達(dá)。

郭克勤等[19]通過實驗發(fā)現(xiàn)， VEGF與膠質(zhì)瘤的新生血管生成密切相關(guān)，主要以旁分泌方式作用于細(xì)胞上的兩種受體誘導(dǎo)血管形成，同時發(fā)現(xiàn)VEGF在高級別膠質(zhì)瘤中表達(dá)高于低級別膠質(zhì)瘤。魏秀麗等[20]通過實驗證實VEGF在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與分級有關(guān)，與性別、年齡及部位無關(guān)。而本實驗發(fā)現(xiàn)VEGF的表達(dá)與部位有關(guān)(P<0.05)，高級別膠質(zhì)瘤表達(dá)高于低級別膠質(zhì)瘤，但與分級無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)之所以如此，可能跟本實驗樣本量較少，結(jié)果為人工判讀存在一定誤差有關(guān)。

研究表明[10]：在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，IDH1突變的組織中，HIF-1α及血清中的VEGF的水平顯著增加。而本實驗發(fā)現(xiàn)IDH1R132H、HIF-1α及VEGF在正常對照組中不表達(dá)，膠質(zhì)瘤中明顯高表達(dá)(P<0.05)，3個指標(biāo)均陽性表達(dá)有9例，與膠質(zhì)瘤患者的性別、年齡、分級及部位無關(guān)(P>0.05)，3個指標(biāo)均陽性在II、III級中表達(dá)，但與膠質(zhì)瘤的分級無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能與實驗樣本量不足及結(jié)果判讀有關(guān)。

綜上所述， HIF-1α表達(dá)與年齡有關(guān)，VEGF的表達(dá)與膠質(zhì)瘤部位有關(guān)，HIF-1α與VEGF在膠質(zhì)瘤的發(fā)展中起協(xié)同作用。