譚 楨 張 丹 程建文 李曉峰

(1 廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院骨科，南寧市 530007；2 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科，南寧市 530021；3 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手外科，南寧市 530021)

骨重建包括骨形成和骨吸收兩種相互平衡的過程，分別由成骨細胞和破骨細胞調控[1]。破骨細胞的過度作用導致骨吸收增多，打破骨形成和骨吸收的平衡，將引起如骨質疏松癥等疾病，破骨細胞在這類疾病中的作用非常關鍵[2]。

骨保護素/核因子-κB受體活化因子配體/核因子-κB受體活化因子(OPG/RANKL/RANK)通路與破骨細胞的形成和分化密切相關[3]，通過RANKL/RANK信號的刺激，促進破骨細胞分化[4]。有研究表明，柚皮苷具有抑制破骨細胞分化及抗骨質疏松的作用[5]。新橙皮苷是一種枳實提取物，與柚皮苷均為黃酮類化合物[6]，具有保護心血管系統(tǒng)、抗腫瘤及抗炎等作用[7]。但有關新橙皮苷對破骨細胞作用的研究仍較少。我們通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，不同濃度的新橙皮苷對破骨細胞的凋亡率及活力無影響，但是能抑制破骨細胞的分化，且具有時間依賴性?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 α-MEM液和胎牛血清購自澳大利亞TRACE公司，GST-rRANKL購自澳大利亞西澳大學分子生物學實驗室，新橙皮苷(純度>98%)購自成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 破骨細胞凋亡實驗 將RAW264.7細胞種植至含有胞分化培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板內，細胞培養(yǎng)過夜。第二天更換培養(yǎng)基，將不同濃度的新橙皮苷加入培養(yǎng)孔中，濃度分別為0 μM、1 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM和20 μM，孵育細胞24 h。用PBS洗滌兩次后收集細胞，用0.5 mL Annexin V Binding緩沖液重懸細胞以及Annexin V-PE液染色細胞懸浮液。在室溫暗室繼續(xù)孵育細胞15 min，最后加入Binding緩沖液，通過流式細胞儀進行分析并獲得健康細胞率、細胞死亡率以及細胞凋亡率。

1.3 破骨細胞活力的測定 將小鼠骨髓巨噬細胞以6×103個/孔的密度種植入含有細胞分化培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板，分5組，每組3個孔。加入RANKL培養(yǎng)過夜,加入不同濃度的新橙皮苷(0 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM、20 μM)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸取20 μL CellTiter 96?試劑，分別加入96孔培養(yǎng)板的每個細胞樣本孔中。在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用ELISA檢測儀測量樣本在490 nm的光吸收值，以新橙皮苷濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制直方圖。

1.4 破骨細胞生成抑制時間依賴性實驗 將小鼠骨髓巨噬細胞分為對照組和實驗組，對照組為D0組(NE-)，實驗組第0天為D0組(NE+)，第1天為D1組(NE+)，第3天為D3組(NE+)，第5天為D5組(NE+)，第7天為D7組(NE+)，每組3個孔。將骨髓巨噬細胞以6×103個/孔種植入96孔培養(yǎng)板，分別于第0、1、3、5、7天給D0組(NE+)、D1組(NE+)、D3組(NE+)、D5組(NE+)、D7組(NE+)加入新橙皮苷10 μM。對照組D0組(NE-)從第0天開始只加入RANKL培養(yǎng)，不加入新橙皮苷。第8天，將各組作TRAP染色。在光學顯微鏡下計數(shù)破骨細胞，將細胞核≥3個的細胞歸類為破骨細胞，并對TRAP染色陽性的破骨細胞拍照。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SSPS 18.0統(tǒng)計學軟件包進行數(shù)據(jù)分析。實驗組與各自的對照組進行兩兩比較，計量資料以均數(shù)±標準差( x±s)表示，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 破骨細胞凋亡情況 散點圖結果顯示各組健康細胞率分別為94.9%、91.4%、92%、93.9%、91.8%、93.2%，壞死率分別為4.5%、8.1%、7.4%、5.7%、7.8%、6.4%，凋亡率分別為0.6%、0.5%、0.5%、0.5%、0.4%、0.4%。隨著新橙皮苷濃度的增加，各組健康細胞率均保持于90%以上的高水平，而壞死率和凋亡率均維持在低水平(圖1A、B)。

A.破骨細胞凋亡散點圖

B.各類細胞狀況

圖1 破骨細胞凋亡實驗。A.用RANKL誘導RAW264.7細胞，同時加入各濃度新橙皮苷，培養(yǎng)24 h后用Annexin V-PE 液染色細胞，進行流式細胞儀分析。B.經(jīng)過不同濃度新橙皮苷處理的RAW264.7細胞，凋亡率均低于1%，而健康細胞率均高于90%。

2.2 新橙皮苷對破骨細胞活力的影響 各組吸收值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。以0 μM組為對照，各濃度組藥物對細胞活力均無影響(P>0.05)。見圖2。

圖2 新橙皮苷對破骨細胞活力的影響

2.3 破骨細胞生成抑制時間依賴性實驗 結果顯示D0組(NE-)形成的破骨細胞數(shù)平均為87.3個，D0組(NE+)為82.7個，D1組(NE+)為74個，D3組(NE+)61.3個，D5組(NE+)61.7個，D7組(NE+)64.3個。第1、3、5、7天加入10 μM的新橙皮苷均對破骨細胞形成有抑制作用(P<0.01)，其中第5天加入的新橙皮苷對破骨細胞形成抑制作用最為顯著(P<0.001)(圖3)。

圖3 破骨細胞生成抑制時間依賴性實驗

3 討 論

骨質疏松是一種“沉默的疾病”，往往到發(fā)生骨折時才被發(fā)現(xiàn)[8]。中草藥治療骨骼疾病的歷史悠久，它能促進骨折愈合，而且安全性比化學藥品更高[9-11]，是目前治療骨質疏松的研究熱點之一。

枳實是常見的中藥，可提取出各種黃酮類化合物[6]，如柚皮蕓香苷(narirutin)、柚皮苷(naringin)、橘皮苷(hesperidin)、析圣草枸櫞苷(neoeriocitrin)和新橙皮苷(neohesperidin)。黃酮類化合物具有天然的抗氧化特性，能保護心血管系統(tǒng)、抗腫瘤及抗炎等[12-16]。柚皮苷已被證實在骨質疏松治療方面有獨特優(yōu)勢[5，17]。

本實驗旨在研究新橙皮苷對破骨細胞分化的影響，探討其潛在的骨質疏松治療作用。目前常用的破骨細胞前體細胞是骨髓巨噬細胞和RAW264.7細胞[18-20]。BMM容易貼壁[21]，不易制成細胞懸液，而RAW264.7細胞克隆表達RANK mRNA，能穩(wěn)定地保留RANKL誘導破骨細胞的遺傳特性和表型，基因表達與骨髓巨噬相似，且能制成細胞懸液，非常適合用來研究破骨細胞的分化[22]。因此在使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率實驗中，我們采用RAW264.7細胞。結果表明，加入不同濃度新橙皮苷后，健康細胞率均在90%以上，而凋亡率始終維持在低水平。

為了進一步檢測新橙皮苷的安全性，我們進行了細胞活力實驗。目前常用的細胞活力實驗有MTT和MTS法[23]，而MTS形成的甲瓚產(chǎn)物可溶于水，毒性更少[24]，而且較μTT步驟簡單。因此，我們采用MTS法進行檢測，結果顯示不同濃度的新橙皮苷對小鼠骨髓巨噬細胞分化的破骨細胞活力無明顯影響。

目前對破骨細胞分化的信號通路已有共識，其中RANKL/RANK信號通路是影響破骨細胞分化的主要通路。RANK屬于TNF家族受體，RANKL激活RANK后，使下游一系列蛋白產(chǎn)生級聯(lián)反應，包括IκB、NF-κB、ERK和cJun/AP-1，促進破骨細胞增殖和分化[25-26]。RANKL/RANK信號通路在調控生理性骨吸收的同時，也能調控病理性骨吸收[27]。

在骨破壞性疾病如骨質疏松癥發(fā)病機制中破骨細胞過度的骨吸收起關鍵作用。因此，抑制破骨細胞的形成或活性可以作為治療骨質疏松癥的一個途徑?？梢酝ㄟ^抑制破骨細胞前體細胞分化為TRAP陽性多核巨細胞，抑制細胞骨架、細胞功能形成和影響成熟破骨細胞生存等多方面進行干預[28]。

在破骨細胞生成抑制時間依賴性實驗中，于各時間點在小鼠骨髓巨噬細胞中加入RANKL及10 μM新橙皮苷進行分化誘導。結果顯示新橙皮苷對RANKL誘導的破骨細胞形成具有時間依賴性抑制作用，提示新橙皮苷影響RANKL/RANK信號通路，抑制下游一系列蛋白級聯(lián)反應，從而抑制破骨細胞分化。

綜上所述，新橙皮苷能很好地抑制破骨細胞的分化，同時對細胞凋亡及細胞活力無明顯影響，為進一步探討影響破骨細胞分化機制的實驗研究以及尋找安全有效的抗骨質疏松藥物的研究奠定基礎。