隋雪 姜遠(yuǎn)英 閻瀾

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433；2.大連醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，大連 116044)

白念珠菌是一種條件性致病真菌，與人體共生，然而，當(dāng)人體變得虛弱易感，白念珠菌就會(huì)顯現(xiàn)出強(qiáng)大的致病力，不但能引起宿主黏膜感染，如表皮損傷、腸道菌群失調(diào)，甚至能擴(kuò)散入血，產(chǎn)生威脅生命的侵襲性感染[1-2]。其中，大多數(shù)受感染的宿主都是一些癌癥患者、艾滋病患者、器官移植者、深部外科手術(shù)者和廣譜抗生素過(guò)量使用者，以及其他先天或后天因素導(dǎo)致的免疫力低下者[3]。近年來(lái)，深部白念珠菌感染發(fā)病率逐年升高[4]。然而，治療系統(tǒng)性真菌感染可選的治療方案卻很有限，藥物主要有多烯類(lèi)(如兩性霉素B和制霉菌素)，三唑類(lèi)(如氟康唑、伏立康唑)，丙烯胺類(lèi)(如特比奈芬)，嘧啶類(lèi)(如氟胞嘧啶)和棘白菌素類(lèi)(如卡泊芬凈)等[5]，菌株耐藥性和藥物毒性成為了臨床治療的潛在問(wèn)題[6-7]。疫苗作為一種有效、毒副作用小的治療手段將被眾多研究者關(guān)注，基于疫苗免疫的預(yù)防和治療方案也正成為抵抗白念珠菌感染的新策略。

細(xì)胞壁位于白念珠菌細(xì)胞的最外層，在真菌的生長(zhǎng)繁殖、假菌絲的形成和與宿主的相互作用中發(fā)揮著重要作用，與此同時(shí)，真菌的細(xì)胞壁是病原體區(qū)別于宿主的獨(dú)一無(wú)二的部分[8]，因此成為了抗真菌藥物的理想靶標(biāo)。Csp37蛋白是白念珠菌細(xì)胞壁蛋白，分子量為37kDa。Sentandreu M[9]等人研究發(fā)現(xiàn)，Csp37蛋白在白念珠菌菌絲生長(zhǎng)和黏附中發(fā)揮著重要作用，在小鼠尾靜脈注射0.5×106cells或者1×106cells或者1.5×106cells的CSP37基因缺失菌后，與野生型對(duì)照組相比，感染小鼠平均存活時(shí)間均有所延長(zhǎng)，說(shuō)明CSP37基因敲除能明顯的降低白念珠菌毒力。本研究主要應(yīng)用生物信息學(xué)方法，對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白Csp37抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)和免疫原性分析，尋找B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位共有的序列區(qū)，探討其作為抗白念珠菌感染疫苗靶點(diǎn)的潛能。

1 材料與方法

1.1 材料

從美國(guó)生物信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫(kù) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載白念珠菌SC5314的細(xì)胞壁蛋白Csp37的氨基酸序列，該序列為全基因組測(cè)序預(yù)測(cè)獲得，Genebank登錄號(hào)為KHC71123.1，具體序列見(jiàn)表1。

1.2 方法

本研究主要利用計(jì)算機(jī)軟件和在線(xiàn)分析軟件，具體信息見(jiàn)表2，對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁蛋白Csp37進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)。采用ProtParam在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)Csp37蛋白的分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)。采用SignaIP 3.0和TMHMM在線(xiàn)軟件分別預(yù)測(cè)Csp37蛋白的信號(hào)肽和跨膜區(qū)，用GOR4在線(xiàn)軟件分析Csp37蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。采用DNAStar軟件中的Protean模塊分析Csp37蛋白的氨基酸序列，根據(jù)Kyte-Doolittle方案預(yù)測(cè)其親水性，Emini方案預(yù)測(cè)其表面可及性，Karplus-Schulz方案預(yù)測(cè)其柔韌性，Jameson-Wolf方案預(yù)測(cè)其抗原性指數(shù)，綜合上述參數(shù)預(yù)測(cè)Csp37蛋白可能的B細(xì)胞抗原表位。采用ABCPred和Syfpeithi在線(xiàn)軟件進(jìn)一步分別預(yù)測(cè)Csp37蛋白B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位。最后，綜合分析B細(xì)胞和T細(xì)胞共有抗原表位。

表1 Csp37蛋白的氨基酸序列

表2 生物信息學(xué)軟件

2 結(jié) 果

2.1 Csp37蛋白的基本理化性質(zhì)

利用ProtParam網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器分析Csp37蛋白理化性質(zhì)，顯示該蛋白分子式為：C1635H2537N453O527S1，原子總數(shù)為5 153個(gè)，分子量為37.0 KD，理論等電點(diǎn)為6.57。在氨基酸組成上：Lys (K)有48個(gè)，占15.0%，含量最高；其次，Asp (D)有33個(gè)，占10.3%；負(fù)電荷殘基 (Asp+Glu)總數(shù)為55，正電荷殘基 (Arg+Lys)總數(shù)為54。不穩(wěn)定系數(shù)為24.98，低于閾值40，預(yù)測(cè)該蛋白為穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為61.96，親水性評(píng)估值為-1.147，依據(jù)分值越低親水性越強(qiáng)，分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律，預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白。

2.2 Csp37蛋白信號(hào)肽、跨膜區(qū)分析

通過(guò)SignaIP 3.0和TMHMM軟件預(yù)測(cè)Csp37蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)該蛋白無(wú)信號(hào)肽、無(wú)跨膜區(qū)，初步分析該蛋白不是分泌型蛋白。

2.3 Csp37蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用GOR 4在線(xiàn)軟件對(duì)Csp37蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖1，發(fā)現(xiàn)α-螺旋占15.8%；β-折疊占28.2%；無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)域占54.0%，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

2.4 Csp37蛋白的親水性、蛋白表面可及性、柔韌性及抗原指數(shù)

預(yù)測(cè)的結(jié)果如圖2所示，圖中柔韌性為有線(xiàn)段標(biāo)記區(qū)域；抗原指數(shù)、親水性及表面可及性為各自橫線(xiàn)以上部分，當(dāng)親水性>0，抗原指數(shù)>0，表面可及性>1時(shí)，形成表位的可能性大，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表3 GOR4分析的Csp37蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

表4 DNAStar軟件預(yù)測(cè)Csp37蛋白的親水性、蛋白表面可及性、可塑性及抗原指數(shù)

圖1 GOR4分析的Csp37蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu) 圖2 DNAStar軟件預(yù)測(cè)Csp37蛋白的親水性、蛋白表面可及性、可塑性及抗原指數(shù)

Fig.1Secondary structure of Csp37 using GOR4 analysis (Alpha helix (Hh), Extended strand (Ee), Random coil (Cc))Fig.2DNAStar prediction results of hydrophilicity, surface probability, flexible regions and antigenic index of Csp37

2.5 Csp37蛋白的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)

使用在線(xiàn)預(yù)測(cè)軟件ABCPred預(yù)測(cè)，每組表位的氨基酸殘基數(shù)選擇默認(rèn)值16，得分閾值設(shè)置為默認(rèn)值0.54，獲得具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。氨基酸序列的得分越高，越有可能成為B細(xì)胞表位。根據(jù)抗原表位的基本預(yù)測(cè)原則，即抗原指數(shù)高；親水性、可塑性和表面可及性好；二級(jí)結(jié)構(gòu)避免α螺旋和β折疊，優(yōu)選 β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則線(xiàn)圈，得到9個(gè)較好的B細(xì)胞表位，具體區(qū)域?yàn)椋?9-24，45-48，76-78，100-105，153-158，179-184，222-225，249-252，303-305 aa。

2.6 Csp37蛋白的T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)

選擇中國(guó)各民族中基因頻率較高的HLA-DRB1*0301，利用在線(xiàn)軟件Syfpeithi對(duì)Csp37蛋白的T細(xì)胞抗原表位親和力進(jìn)行預(yù)測(cè)[18]，結(jié)果顯示評(píng)分大于等于18的序列，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表6。其中，評(píng)分較高 (≥25)的T細(xì)胞表位8個(gè)，具體區(qū)域?yàn)椋?7-111,303-317,257-271,299-313，221-235，281-295，137-151，235-249 aa。

2.7 Csp37蛋白的B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位綜合分析

綜合B細(xì)胞與T細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)結(jié)果，分析比較，取各項(xiàng)參數(shù)比較相一致的序列，確定Csp37蛋白B細(xì)胞和T細(xì)胞共同表位5個(gè)，具體優(yōu)勢(shì)區(qū)域?yàn)椋?5-48，76-78，153-158，222-225，303-305 aa。

3 討 論

隨著抗腫瘤放化療、介入治療、器官移植術(shù)后免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，尤其是艾滋病的流行，免疫功能低下或缺陷的患者數(shù)量不斷增加，侵襲性真菌感染已逐漸成為一種常見(jiàn)病、多發(fā)病，并已成為免疫功能低下人群死亡的主要原因。念珠菌是機(jī)會(huì)性致病真菌中的主要一屬，其中白念珠菌的毒力最強(qiáng)，感染率最高，引起嚴(yán)重的侵襲性念珠菌病，死亡率高達(dá)40%。開(kāi)發(fā)一種有效的毒副作用小的疫苗，對(duì)于抗白念珠菌感染的預(yù)防和治療具有重要意義。

表5 ABCpred預(yù)測(cè)Csp37蛋白的B細(xì)胞表位

表6Syfpeithi預(yù)測(cè)Csp37蛋白的HLA-DRB1*0301限制性T細(xì)胞表位

Tab.6Prediction of HLA-DRB1*0301 restricted T cell epitopes of Csp37 using Syfpeithi

序號(hào)序列起始位點(diǎn)評(píng)分1EDAVDNDKNVFVVGI97281GDDVYNDFAKRFDDL303282AIKGVEDAKSNFEKL257272LKLFGDDVYNDFAKR299273YEQAKGDWNKALDDL221263KNQKLKDAQDHFGKS281 264SPNVEVKEKSIFGNW137254LSKQWNDSKKQLNGR235255VDQLKNDADKKINEA159225FEKLSNDLANDASKN268226KQVKNSDVYQKLQSN 74 216DKNVFVVGIQKYIDF 103 216SNDLANDASKNQKLK 272 216LENLKLFGDDVYNDF 296 216NLKLFGDDVYNDFAK 298 217KKADELDKKANEAIN190 208VQPILPRQQHQELAY 24 198QPILPRQQHQELAYQ 25 198VFVVGIQKYIDFVNQ 106 198GIQKYIDFVNQLGEG 110 198YSTVSPNVEVKEKSI 133 198NWFDKSDNKVDQLKN 150 198DHFGKSLENLKLFGD 290 199VENKGSELNNKLTKK 43 189TKKIEEGKKFVNEKT 55 189TESVTKQVKNSDVYQ 69 189NSDVYQKLQSNTEDY 78 189LQSNTEDYKKHVEDA 85 189IDFVNQLGEGKVQTG 115 189DNKVDQLKNDADKKI 156 189QLKNDADKKINEAKD 161 189NKALDDLSKQWNDSK 229 18

近年來(lái)，生物信息學(xué)廣泛運(yùn)用于蛋白質(zhì)抗原表位的預(yù)測(cè)，不僅節(jié)約了科研時(shí)間、降低了科研經(jīng)費(fèi)，而且優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。所謂抗原表位是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，抗原可以借表位與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合而發(fā)揮免疫效應(yīng)。理想的抗原表位是兼有B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位的功能，其中T細(xì)胞僅能識(shí)別抗原遞呈細(xì)胞加工處理的線(xiàn)性表位，B細(xì)胞則既可以識(shí)別線(xiàn)性表位又可以識(shí)別構(gòu)象表位。正確預(yù)測(cè)表位和分析蛋白免疫原性將對(duì)疫苗和單克隆抗體的研發(fā)具有很大的幫助。

本研究運(yùn)用多種生物信息學(xué)軟件，綜合分析預(yù)測(cè)了白念珠菌細(xì)胞壁蛋白Csp37的抗原表位。首先，了解了該蛋白為親水性蛋白，無(wú)信號(hào)肽，非跨膜蛋白；其次，優(yōu)選抗原指數(shù)高[19]，親水性、柔韌性和表面可能性良好的序列[20]，以滿(mǎn)足上述4種中3種條件的序列為初選表位序列，另外，由于α-螺旋、β-折疊的化學(xué)鍵能較高 ,不易形成抗原表位，所以應(yīng)盡量避免，而優(yōu)選β轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)卷曲等較松散的二級(jí)結(jié)構(gòu)[20]；最后，將上述獲得的候選表位序列與預(yù)測(cè)的B細(xì)胞表位序列相結(jié)合，在輔以預(yù)測(cè)T細(xì)胞表位序列，確定Csp37蛋白B細(xì)胞和T細(xì)胞共同表位優(yōu)勢(shì)區(qū)域。

本研究盡管初步預(yù)測(cè)了Csp37蛋白的抗原表位，但還是存在很多問(wèn)題。由于B細(xì)胞表位大部分都是構(gòu)象表位，因此，本研究想通過(guò)SWISS-MODEL在線(xiàn)軟件對(duì)Csp37蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模[21]，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)Csp37蛋白序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中模板序列只有不到20%的一致性，獲得的三維結(jié)構(gòu)可信度較低，無(wú)法用來(lái)作為參考。此外，單參數(shù)預(yù)測(cè)某一蛋白質(zhì)的抗原表位有一定的局限性，在滿(mǎn)足基本的表位條件下，即至少3個(gè)連續(xù)氨基酸以上的序列，最好是6個(gè)以上的連續(xù)氨基酸，而且，應(yīng)該采用多參數(shù)和多方法的綜合預(yù)測(cè)，但在實(shí)施過(guò)程中一直沒(méi)有絕對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測(cè)條件太嚴(yán)格可能得不到序列，預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)降低又會(huì)降低表位預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和特異性，所以，預(yù)測(cè)會(huì)存在小部分的主觀(guān)性,有一定的誤差。最后，表位預(yù)測(cè)是一種經(jīng)驗(yàn)性較強(qiáng)的學(xué)科，需要對(duì)比不同的分析軟件，且對(duì)同一性質(zhì)的預(yù)測(cè)不同軟件基于的原理可能有所不同，進(jìn)而應(yīng)用不同方法對(duì)同一蛋白的表位預(yù)測(cè)可能會(huì)獲得不完全一致的結(jié)果，因此，具體蛋白表位仍需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

整體來(lái)說(shuō)，通過(guò)表位預(yù)測(cè)進(jìn)行抗白念珠菌感染疫苗或抗體的研究仍然較少，本研究利用生物信息學(xué)方法初步分別預(yù)測(cè)到了白念珠菌細(xì)胞壁蛋白Csp37的B 細(xì)胞表位9個(gè)和T細(xì)胞表位8個(gè)，以及共有的優(yōu)勢(shì)抗原表位5個(gè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有豐富的抗原表位，具有誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答的潛能，可以據(jù)此設(shè)計(jì)并合成多肽，作為疫苗研究的新靶點(diǎn)。