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      3種方法檢測艾滋病患者血和腦脊液中隱球菌的結(jié)果分析

      2019-01-21 11:31:14曹宇碩錢雪琴蔡金鳳陳智瑾趙洋洋朱召芹盧洪洲
      中國真菌學(xué)雜志 2018年6期
      關(guān)鍵詞:墨汁層析側(cè)向

      曹宇碩 錢雪琴 蔡金鳳 陳智瑾 趙洋洋 朱召芹 盧洪洲

      (1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科;2.上海市公共衛(wèi)生臨床中心感染與免疫科,上海 201508)

      艾滋病 (Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS),又稱為獲得性免疫缺陷綜合征,是因HIV 侵入機(jī)體,破壞CD4+淋巴細(xì)胞,引起細(xì)胞免疫嚴(yán)重缺陷,導(dǎo)致患者抵抗力降低,繼發(fā)內(nèi)源性及外源性感染、惡性腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)病變?yōu)樘卣鞯呐R床綜合征。AIDS患者合并感染常見真菌有莢膜組織胞漿菌、馬爾尼菲籃狀菌、念珠菌屬、隱球菌屬、耶氏肺孢子菌[1]。隱球菌的檢測方法主要有真菌培養(yǎng)、墨汁染色、隱球菌抗原檢測。我們回顧性分析了2017年1~12月本院收治的AIDS患者不同隱球菌檢測方法的結(jié)果,以期篩選出診斷AIDS合并隱球菌感染較好的檢測方法。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      標(biāo)本來源于2017年1~12月,本院收治并確診的1 049例艾滋病患者的血液和腦脊液。

      1.2 主要試劑

      VITEK 2 YST酵母菌鑒定卡為法國梅里埃生物公司生產(chǎn),成人中和抗生素培養(yǎng)瓶為美國Becton,Dickinson and Company公司生產(chǎn),血平板和沙氏培養(yǎng)基購自上??迫A微生物試劑有限公司,新生隱球菌抗原試劑盒為美國IMMY公司生產(chǎn),墨汁染液為珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

      1.3 方法

      真菌培養(yǎng)和鑒定:抽取腦脊液標(biāo)本1~5 mL和全血標(biāo)本5~10 mL,分別注入BD FX需氧培養(yǎng)瓶,待儀器報(bào)警顯示陽性時(shí),取出標(biāo)本,用注射器吸取少量標(biāo)本,分區(qū)劃線接種于血瓊脂平板和沙氏培養(yǎng)基,分別置于35℃和25℃孵育箱中培養(yǎng)12~24 h,用YST酵母菌生化鑒定卡對其進(jìn)行菌種鑒定。刮取培養(yǎng)基上真菌菌落,用0.45% NaCL 3 mL調(diào)成1.8~2.2 McF真菌懸液,借助VITEK 2鑒定儀,將菌液注入YST鑒定卡的微量生化孔中,鑒定儀通過比色或比濁自動(dòng)判讀生化反應(yīng)結(jié)果,鑒定是否為新生隱球菌。

      墨汁染色:將收集的腦脊液高速離心,3 000 g離心10 min,棄上清,沉淀約以5∶1比例與墨汁混勻鏡檢,在黑色背景下見到出芽或不出芽、大小不均的菌體和透亮的寬厚莢膜為陽性。

      側(cè)向免疫層析法 (LFA):常規(guī)方法收集腦脊液和全血樣本,1 000 g離心15 min,樣品無需預(yù)處理,于試管中滴入1滴標(biāo)本稀釋液,用微量加樣器取40 μL的腦脊液或血清加入試管中,隨后將隱球菌抗原檢測試紙條的白端沒入到混懸液,室溫孵育10 min后進(jìn)行結(jié)果判讀。判讀標(biāo)準(zhǔn):對照區(qū)存在紅色條帶,檢測區(qū)無紅色條帶表明檢測結(jié)果為陰性;對照區(qū)存在紅色條帶,同時(shí)檢測區(qū)也存在紅色條帶表明檢測結(jié)果為陽性;對照區(qū)無紅色條帶存在,無論檢測區(qū)有無紅色條帶均表明此次檢測結(jié)果無效,應(yīng)查找原因。

      統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)意義。

      2 結(jié) 果

      2.1 腦脊液墨汁染色結(jié)果

      328例AIDS患者腦脊液墨汁染色,59例陽性,陽性率為17.99%。

      2.2 真菌培養(yǎng)結(jié)果

      對688例AIDS患者血標(biāo)本進(jìn)行真菌培養(yǎng),19例培養(yǎng)出新生隱球菌,陽性率為2.8%;對316例AIDS患者進(jìn)行腦脊液真菌培養(yǎng),29例培養(yǎng)為新生隱球菌,真菌培養(yǎng)陽性率為9.18%;其中189例患者的血和腦脊液標(biāo)本均進(jìn)行了真菌培養(yǎng),17例患者血標(biāo)本培養(yǎng)出新生隱球菌,陽性率為8.99%,腦脊液培養(yǎng)檢出新生隱球菌22例,陽性率為11.64%。腦脊液真菌培養(yǎng)陽性率高于血培養(yǎng),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=0.71,P>0.05)。血與腦脊液標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果一致性具體見表1。

      表1189例艾滋病患者血與腦脊液標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果一致性比較

      Tab.1Comparison of the results of blood and cerebrospinal fluid culture in 189 AIDS patients

      血液培養(yǎng)腦脊液培養(yǎng)陽性陰性合計(jì)陽性14317陰性8164172合計(jì)22167189

      2.3 腦脊液培養(yǎng)隱球菌檢出率與墨汁染色結(jié)果一致性比較

      313例患者同時(shí)做腦脊液墨汁染色和真菌培養(yǎng),墨汁染色陽性57例,陽性率為18.21%;真菌培養(yǎng)陽性29例,陽性率為9.27%,腦脊液墨汁染色陽性率高于真菌培養(yǎng)陽性率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=10.57,P<0.01),兩者一致性比較見表2。

      表2313例艾滋病患者腦脊液培養(yǎng)與墨汁染色結(jié)果一致性比較

      Tab.2Comparison of cerebrospinal fluid culture and ink staining results in 313 AIDS patients

      腦脊液培養(yǎng)腦脊液墨汁染色陽性陰性合計(jì)陽性26329陰性31253284合計(jì)57256313

      2.4 側(cè)向免疫層析法檢測結(jié)果

      1 049例AIDS患者進(jìn)行側(cè)向免疫層析法檢測,陽性115例,陽性率為10.96%,其中956例患者血標(biāo)本側(cè)向免疫層析法檢測,陽性101例,陽性率為10.56%;294例患者腦脊液進(jìn)行側(cè)向免疫層析法檢測,70例陽性,陽性率為23.81%;201例患者同時(shí)做腦脊液和血側(cè)向免疫層析法檢測,腦脊液陽性56例,陽性率為27.86%,血陽性75例,陽性率37.31%,血側(cè)向免疫層析法檢測陽性率高于腦脊液,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=4.09,P<0.05)。兩種標(biāo)本聯(lián)合檢測一項(xiàng)或兩項(xiàng)陽性例數(shù)為76例,陽性率為37.81%。兩者一致性見表3。

      表3201例艾滋病患者腦脊液和血標(biāo)本側(cè)向免疫層析法檢測結(jié)果一致性比較

      Tab.3Comparison of the results of lateral immunochromatographic assay between cerebrospinal fluid and blood samples of 201 AIDS patients

      腦脊液檢測血標(biāo)本檢測陽性陰性合計(jì)陽性55156陰性20125145合計(jì)75126201

      2.5 腦脊液墨汁染色與側(cè)向免疫層析法檢測結(jié)果比較

      292例AIDS患者同時(shí)做腦脊液墨汁染色和側(cè)向免疫層析法檢測,墨汁染色陽性57例,陽性率19.52%,腦脊液側(cè)向免疫層析法檢測陽性70例,陽性率為23.97%,腦脊液側(cè)向免疫層析法檢測陽性率大于墨汁染色法,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=1.70,P>0.05)。聯(lián)合檢測一項(xiàng)或兩項(xiàng)陽性例數(shù)為73例,陽性率為25%。詳見表4。3例墨汁染色陽性,腦脊液側(cè)向免疫層析法檢測陰性者,有2例血清側(cè)向免疫層析法檢測陽性,滴度分別為1∶2 560和1∶80。

      表4292例艾滋病患者腦脊液墨汁染色與側(cè)向免疫層析法檢測結(jié)果一致性比較

      Tab.4Comparison of the results of cerebrospinal fluid ink staining and lateral immunochromatography in 292 AIDS patients

      腦脊液墨汁染色腦脊液側(cè)向免疫層析法檢測陽性陰性合計(jì)陽性54357陰性16219235合計(jì)70222292

      2.6 血真菌培養(yǎng)與側(cè)向免疫層析法檢測結(jié)果一致性

      338例AIDS患者同時(shí)做血真菌培養(yǎng)和側(cè)向免疫層析法檢測,血真菌培養(yǎng)新生隱球菌陽性5例,陽性率為1.48%;側(cè)向免疫層析法檢測陽性13例,陽性率為3.85%。側(cè)向免疫層析法檢測陽性率高于血真菌培養(yǎng),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=3.65,P>0.05)。兩者聯(lián)合檢測一項(xiàng)或兩項(xiàng)陽性14例,陽性率為4.14%。兩者一致性比較具體見表5。

      2.7 腦脊液真菌培養(yǎng)與側(cè)向免疫層析法檢測結(jié)果比較

      284例AIDS患者同時(shí)做腦脊液培養(yǎng)與側(cè)向免疫層析法檢測,腦脊液真菌培養(yǎng)陽性25例,陽性率為8.80%;側(cè)向免疫層析法檢測陽性68例,陽性率為23.94%,側(cè)向免疫層析法檢測陽性率高于腦脊液培養(yǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=23.77,P<0.01)。兩者一致性具體見表6。

      表5338例艾滋病患者血培養(yǎng)與血側(cè)向免疫層析法檢測結(jié)果一致性比較

      Tab.5Comparison of the results of blood culture and blood lateral immunochromatographic assay in 338 patients with AIDS

      血真菌培養(yǎng)血側(cè)向免疫層析法檢測陽性陰性合計(jì)陽性415陰性9324333合計(jì)13325338

      表6284例艾滋病患者腦脊液培養(yǎng)與側(cè)向免疫層析法結(jié)果一致性比較

      Tab.6Comparison of results of cerebrospinal fluid culture and lateral immunochromatography in 284 AIDS patients

      腦脊液真菌培養(yǎng)腦脊液側(cè)向免疫層析法陽性陰性合計(jì)陽性24125陰性44215259合計(jì)68216284

      3 討 論

      有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)達(dá)國家AIDS患者未經(jīng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒之前,隱球菌播散性感染發(fā)生率為5%~8%[2]。本院收治的AIDS患者中,隱球菌播撒性感染率為10.56%稍高于文獻(xiàn)報(bào)道。

      隱球菌感染檢測方法中,墨汁染色是最常用的方法,操作簡單,用時(shí)短,約需2 min,陽性率為54%~74%[3]。艾滋病合并隱球菌性腦膜炎患者,墨汁染色的敏感性為80%~85%[4],可快速診斷隱球菌感染。其適用的標(biāo)本類型為無菌體液、尿液等,灌洗液、支氣管刷取物和少量痰加水漩渦振蕩后,取上清,也可進(jìn)行墨汁染色。體液標(biāo)本經(jīng)離心沉淀后再進(jìn)行墨汁染色,可提高陽性率。本院采用離心沉淀后墨汁染色,328例AIDS患者腦脊液隱球菌檢出率為17.99%。墨汁染色結(jié)果易受菌量多少、實(shí)驗(yàn)室人員技術(shù)能力、墨汁質(zhì)量等影響,造成假陽性和假陰性結(jié)果出現(xiàn)。一般腦脊液和墨汁的比例為5∶1左右為宜,最好選用接種槍加墨汁和標(biāo)本,即取10 μL墨汁和50 μL腦脊液混勻,小心蓋上蓋玻片,避免產(chǎn)生氣泡,用筆輕壓,先低倍鏡觀察,以見到細(xì)小墨汁顆粒為找到視野,再觀察全片,低倍鏡下閱片不少于300個(gè)視野,當(dāng)黑色或棕色背景下看到無色的、很亮的暈圈,暈圈內(nèi)可見清晰圓形或橢圓形孢子,再轉(zhuǎn)高倍鏡確認(rèn),隱球菌高倍鏡下可見到完整光滑細(xì)胞壁及胞內(nèi)脂質(zhì)顆粒。若低倍鏡下,僅看到漆黑,為墨汁量過多,可輕壓蓋玻片,用濾紙吸去多余染液再觀察,否則易造成假陰性結(jié)果。低倍鏡觀察時(shí),要先將聚光鏡下調(diào),光圈縮小,可觀察到隱球菌清晰的細(xì)胞壁。選擇顆粒細(xì)的墨汁為佳,根據(jù)墨汁不同,適當(dāng)調(diào)整腦脊液與墨汁的比例,可有效提高墨汁染色隱球菌的檢出率。墨汁染色時(shí),紅酵母菌和白吉利毛孢子菌可造成假陽性結(jié)果。有文獻(xiàn)報(bào)道將阿利新藍(lán)染色用于腦脊液隱球菌的檢測,檢出陽性率也可達(dá)80%~90%[5],隱球菌經(jīng)阿利新藍(lán)染色后,莢膜可被染成深藍(lán)色,菌體呈淡藍(lán)色,而周圍的炎性細(xì)胞不著色,染色對比清晰,當(dāng)隱球菌數(shù)目少時(shí)也容易觀察,較傳統(tǒng)墨汁染色隱球菌檢出率高,有條件的實(shí)驗(yàn)室可考慮使用。

      真菌培養(yǎng)是通過對標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定,判斷患者是否發(fā)生隱球菌感染,一般需要28℃和35℃培養(yǎng)3~4 d,個(gè)別新生隱球菌需要延長培養(yǎng)時(shí)間到1周以上,為現(xiàn)階段臨床檢查新生隱球菌的金標(biāo)準(zhǔn),與涂片和隱球菌抗原檢測相比,培養(yǎng)時(shí)間長,不利于患者病情的早期診斷。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]合并感染隱球菌腦膜炎的艾滋病患者,其腦脊液和血標(biāo)本真菌培養(yǎng)的敏感性分別為90%和50%~70%,其中腦脊液培養(yǎng)敏感性隨著標(biāo)本量增加而增高 (10 μL時(shí)為82%,100 μL時(shí)94%)。本院688例AIDS患者血標(biāo)本真菌培養(yǎng),新生隱球菌的檢出率為2.8%,與吳開進(jìn)[6]報(bào)道的2.3% (6/259)血真菌培養(yǎng)陽性率相近。316例AIDS患者腦脊液真菌培養(yǎng)陽性率為8.2%。313例患者同時(shí)做了腦脊液墨汁染色和真菌培養(yǎng),墨汁染色陽性率為18.21%;培養(yǎng)陽性率為9.27%,腦脊液墨汁染色陽性率高于真菌培養(yǎng)陽性率。由于本實(shí)驗(yàn)室血液及無菌體液真菌增菌培養(yǎng)使用的是一般菌需氧培養(yǎng)瓶,而未使用真菌專用培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)條件為35℃,5 d,部分隱球菌可能由于培養(yǎng)時(shí)間短而漏檢;有部分患者由于已接受過抗真菌預(yù)防治療,菌已死而抗原存在,出現(xiàn)墨汁染色陽性而培養(yǎng)陰性。本院真菌培養(yǎng)陽性菌株,經(jīng)VITEK 2系統(tǒng)鑒定,均為新生隱球菌,有文獻(xiàn)報(bào)道[7],API 20C系統(tǒng)、Vitek全自動(dòng)微生物鑒定儀或MicroScan全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)等,目前尚無法區(qū)分新生隱球菌及格特隱球菌,德國布魯克公司的MALDI TOF MS不僅能準(zhǔn)確區(qū)分格特隱球菌和新生隱球菌,還可進(jìn)行分子分型。

      隱球菌抗原 (CrAg)檢測具有很高的敏感性及特異性,可在癥狀出現(xiàn)之前檢測到。目前常用的檢測方法有3種,分別是乳膠凝集法 (LA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)和側(cè)向免疫層析法 (LFA)。3種方法均利于患者病情的早期診斷,監(jiān)測隱球菌抗原滴度的下降,可作為抗隱球菌療法有效的指示。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]以培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn),LA在血標(biāo)本和腦脊液的敏感性分別為83%~97%和93%~100%,特異性分別為93%~100%和93%~98%。ELISA法敏感度高于LA法,其檢測血標(biāo)本的敏感性和特異性分別為94%和96%,檢測腦脊液的敏感性和特異性分別為100%和98%,但操作繁瑣,需要配置額外設(shè)施,對新生隱球菌 (血清型D)和格特隱球菌 (血清型C)檢測敏感性低。LA具有檢測需要時(shí)間短,操作方便,其局限性為結(jié)果判讀受人為因素影響較大,需要對標(biāo)本進(jìn)行前處理,對格特隱球菌 (血清型C)敏感性低。ELISA法和LA法試驗(yàn)的假陽性率為0.0%~0.4%[7]。本文采用的是LFA法,該方法是IMMY公司繼乳膠凝集法后新研發(fā)的試劑盒,其在常溫狀態(tài)下性質(zhì)穩(wěn)定,操作簡便且耗時(shí)短 (10 min),對結(jié)果的判定簡單、準(zhǔn)確,標(biāo)本不需前處理,敏感性高于LA法和ELISA法[8]。對所有血清型新生隱球菌和格特隱球菌均有很高的敏感性。有文獻(xiàn)報(bào)道LFA對隱球菌病的診斷敏感性和特異性可達(dá)到100%,特別是檢測低濃度的莢膜抗原方面,與LA相比具有更高的敏感性[9]。本文中1 049例AIDS患者進(jìn)行LFA法檢測,陽性率為10.96%;201例同時(shí)做腦脊液和血標(biāo)本的LFA法檢測,腦脊液陽性56例,陽性率為27.86%,血標(biāo)本陽性75例,陽性率37.31%,有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)CSF中隱球菌莢膜抗原檢測為陽性時(shí),血液中檢測其敏感性可達(dá)99%,應(yīng)用LFA檢測指尖血、血清、血漿和腦脊液,CrAg的結(jié)果一致性100%[10],說明檢測指尖血CrAg簡單可行性;應(yīng)用LFA檢測尿液及唾液中CrAg的效果差,有待進(jìn)一步研究[11]。對于3例墨汁染色陽性,腦脊液LFA法檢測陰性者,其中2例血清LFA法檢測陽性,具體原因待研究。

      總之,通過回顧性分析2017年本院收治的AIDS患者標(biāo)本,用3種方法檢測隱球菌的陽性率,以血培養(yǎng)陽性率最低,腦脊液標(biāo)本墨汁染色與LFA法檢測陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,血標(biāo)本LFA法檢出率最高,可作為AIDS患者合并隱球菌感染較理想的早期診斷方法。

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