孫 凱 劉麗駿 張倩倩 蔣偉文

衰老是隨著年齡的增大，生物發(fā)生的結(jié)構(gòu)功能開始發(fā)生退行性變的一種趨向死亡的不可逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象[1]。目前，針對全身衰老的研究是國際研究的熱點(diǎn)。學(xué)者們已建立了多種全身衰老的動(dòng)物模型，揭示了衰老相關(guān)的分子機(jī)制和信號通路，并發(fā)現(xiàn)針對其進(jìn)行相關(guān)干預(yù)可以延長動(dòng)物壽命。與成熟的全身衰老研究相反，衰老與口腔黏膜疾病的機(jī)制研究并沒有引起足夠關(guān)注。實(shí)際上，衰老對口干癥等口腔疾病的發(fā)生密切相關(guān)[2]，而口干則會繼發(fā)牙周病、根面齲等疾病，出現(xiàn)牙齒松動(dòng)脫落或冷熱酸痛等癥狀，影響進(jìn)食，從而對全身營養(yǎng)攝入產(chǎn)生不利影響。遺憾的是，國內(nèi)外尚無針對口腔黏膜衰老的動(dòng)物模型。因此，建立一個(gè)口腔黏膜衰老的動(dòng)物模型，為防治口腔黏膜衰老相關(guān)疾病提供工具,具有很強(qiáng)的科學(xué)意義。

目前，學(xué)者們對口腔黏膜上皮增齡性改變的結(jié)論并不一致。Scott等發(fā)現(xiàn)隨著年齡增加，人舌腹被覆黏膜上皮厚度減少約30%左右[3]。Sakai等發(fā)現(xiàn)在鼠牙齦細(xì)胞和結(jié)合上皮細(xì)胞并沒有增齡性變化[4]。理論上說，采用自然衰老鼠進(jìn)行衰老研究最符合人類衰老的特點(diǎn)。在大鼠的生長過程中，其月齡與人年齡有著對應(yīng)的關(guān)系(表1)。目前，老年動(dòng)物飼養(yǎng)周期長和易死亡是其模型建立的兩大瓶頸。據(jù)此，我們擬研究Wistar大鼠自然衰老過程中口腔頰黏膜上皮厚度的改變，為口腔黏膜人工衰老模型的后期開發(fā)提供自然衰老鼠的對照數(shù)據(jù)。

表1 大鼠月齡與人年齡對應(yīng)關(guān)系圖

1.材料和方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)鼠選用雄性Wistar大鼠。3月齡鼠3只，作為青年組；12月齡鼠3只，作為中年組；24月齡鼠3只，作為老年組。本研究所涉及大鼠均來源和飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[使用許可合格證號SYXK(滬)2012-0007]。飼料選用有生產(chǎn)許可證的商品飼料，經(jīng)Co60消毒后使用。飲用水為無菌過濾水。設(shè)施內(nèi)動(dòng)物換氣次數(shù)每小時(shí)8～15次，氨濃度＜20ppm，相對濕度40%～80%，濾過后空氣潔凈度為10000級，噪聲＜50dB，溫度20℃～23℃。本研究已獲上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)[倫理號：滬科動(dòng)倫(2018)59]。

1.2 方法 將Wistar大鼠飼養(yǎng)至相應(yīng)月齡后，稱取體重，按0.4ml/100g的劑量于腹腔注射水合氯醛進(jìn)行麻醉。待麻醉起效后，取鼠口腔自口角向內(nèi)的頰黏膜組織，大小約為1cm×1cm，深度5mm，放入福爾馬林中浸泡24h，石蠟包埋，4μm切片，行蘇木精伊紅(Hematoxylin/Eosin，HE)染色。染色具體步驟為：蘇木精染色2min；流水沖洗2min；1%鹽酸酒精作用2s；流水沖洗10s；氨溶液復(fù)藍(lán)15s；流水沖洗5min；80%酒精作用20s；1%伊紅液染色15s；95%酒精作用20s；95%酒精作用20s兩次；二甲苯作用3min兩次。

將HE染色載玻片于正置顯微鏡下400倍放大的視野中觀察，每張玻片隨機(jī)取5個(gè)視野，測量自上皮釘突處基底層底端至粒層頂端的厚度和自粒層頂端至角化層頂端的厚度(圖1)，該兩項(xiàng)指標(biāo)分別代表了上皮增殖和成熟的能力。

圖1 上皮厚度主要觀察指標(biāo)示例

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 我們采用了SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，三組間比較首先進(jìn)行方差齊性分析。如方差齊采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。如方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)，結(jié)果用中位數(shù)±四分位數(shù)間距表示。P＜0.05代表差異具有顯著性。

2.結(jié)果

通過對Wistar大鼠口腔頰黏膜上皮進(jìn)行的HE染色發(fā)現(xiàn)，老年組的上皮角化層、粒層的層數(shù)大于青年組或中年組，青年組和中年組之間差異不明顯(圖 2)。

老年組的Wistar大鼠口腔頰黏膜上皮基底層至粒層平均厚度為125.1±34.4μm，中年組的平均厚度為77.2±51.0μm，青年組的平均厚度為65.9±27.4μm，老年組顯著高于青年組(P＜0.001)和中年組(P=0.004)(圖3A，單因素方差分析)。

同樣地，在鼠上皮角化層方面，老年組的平均厚度為50.1±31.1μm，中年組的平均厚度為16.3±15.4μm，青年組的平均厚度為16.4±12.5μm，老年組顯著高于青年組(P＜0.001)和中年組(P＜0.001)(圖3B，單因素方差分析)。

圖2 Wistar大鼠口腔頰黏膜上皮HE染色(×400)

圖3 上皮厚度的增齡性變化散點(diǎn)圖

3.討論

目前，口腔黏膜衰老的機(jī)制并不明確?？谇火つにダ鲜竽Ｐ涂蔀榭谇火つにダ蠙C(jī)制的研究提供新的工具。然而，老年自然衰老鼠具有飼養(yǎng)周期長的缺點(diǎn)，而現(xiàn)成的老年鼠不易獲得。本研究自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買得目前市場上能夠得到的年齡最大的12月齡Wistar大鼠，并將其飼養(yǎng)12月從而獲得24月齡老齡鼠。因此，本研究獲得老年鼠的上皮厚度的增齡性變化數(shù)據(jù)顯得十分珍貴。

十年前，巴西學(xué)者曾研究了雌性家鼠舌背這一黏膜上皮厚度的增齡性變化[5]，發(fā)現(xiàn)角化層厚度在中年和老年鼠中顯著高于青年組，這與本研究在頰黏膜中的結(jié)果一致，可能與老年鼠進(jìn)食時(shí)間較長所引起的過角化有關(guān)。不同的是，巴西學(xué)者發(fā)現(xiàn)基底層至粒層厚度隨月齡增加出現(xiàn)降低的趨勢，而我們則發(fā)現(xiàn)隨月齡增加出現(xiàn)升高的趨勢，這可能與取材黏膜類型和實(shí)驗(yàn)鼠種類不同有關(guān)。

本研究仍有一定的局限性，如青年、中年、老年鼠數(shù)量各僅有3只，增加了結(jié)果的不確定性，今后可適當(dāng)增加每組樣本數(shù)量。在時(shí)間分布上，許多研究僅設(shè)置2個(gè)研究時(shí)間點(diǎn)[6-8]，即青年和老年，本研究觀察的時(shí)間點(diǎn)為3個(gè)，今后的研究可再適當(dāng)增加觀察時(shí)間點(diǎn)，以獲得更有月齡連續(xù)性的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。目前，人工衰老鼠模型包括D-半乳糖給藥法、臭氧損傷法和去除胸腺法等的研究已較為成熟，未來可嘗試進(jìn)行人工衰老造模，以期獲得更多的口腔黏膜衰老研究工具。